一种人的核糖体蛋白Ｓ２０蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种自身免疫性肝炎特异的蛋白质核糖体蛋白Ｓ２０及其应用。该蛋白质具有序列表中ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．２所示氨基酸序列。本发明专利技术还公开了用其基因克隆表达该蛋白质，并进行蛋白质芯片和酶联免疫吸附试验检测的方法，由本方法制备的核糖体蛋白Ｓ２０可用于自身免疫性肝炎的诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人的核糖体蛋白S20自身抗原，更具体地说是一种自身免疫性疾 病特异抗原核糖体蛋白S20，在制备检测自身免疫性疾病试剂盒中的应用及含有该自身抗 原的检测试剂盒，属于生物工程和疾病诊断领域。
技术介绍
自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis, AIH)又称自免肝，是一种非病毒性的慢 性肝炎，其致病原因不明，临床表现为慢性肝细胞发炎及坏死。如治疗不及时，AIH重症患 者仅有50%的5年存活率。中国人群中AIH的患病率较低，但随着临床经验的积累以及实 验室诊断技术的进步，我国人群中这类疾病逐渐增多。只有通过早期发现，才有可能对病期 进行更准确的评估，尽早地进行针对性治疗，从而提高生存率，改善预后。AIH患者血清内能检测到多种自身抗体，如抗核抗体 (anti-nuc 1 earautoantibody, ANA)、㈱〒胃矶㈱^本(smooth muscle autoantibody, SMA)、 抗月干肾微粒体抗体(anti-liver and kidney microsomal antigens, anti—LKM)等。巨前 临床检验科常用间接免疫荧光法(indirectimmunofluoresence，IIF)检测，即用啮齿类动 物组织或ifep-2细胞制备成组织/细胞芯片，与患者血清反应，继之以荧光标记的抗人IgG 抗体检测血清抗体和芯片上抗原的结合，通过荧光图像判断，主观性强。近年来，对AIH自 身抗体靶标进行了探索，已知的有CYP2D6、ASGP-R、F-actin等，为使用客观的诊断方法提 供了分子基础。蛋白质芯片技术可以全面地分析血清的抗体谱，提供具有疾病特异性的自身抗体 标志物。核糖体蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)是1993年从人皮肤血管内皮细 胞cDNA文库中克隆出的一个核糖体结构蛋白的基因。该基因编码119个氨基酸。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题本专利技术的第一个目的是提供一种特异性自身免疫性肝炎RPS20抗原。本专利技术的第二个目的是提供RPS20抗原在制备人自身免疫性肝炎的蛋白质芯片 检测试剂及其相应试剂盒的用途。本专利技术的第三个目的是提供RPS20抗原在制备人自身免疫性肝炎的ELISA检测试 剂及其对应ELISA检测试剂盒的用途。解决技术问题所采用的技术手段本专利技术利用蛋白质芯片技术，首先利用5000人类蛋白质芯片比较AIH和健康对照 的血清抗体谱，筛选出14个与AIH相关的候选自身抗原。然后制备该14个候选抗原的蛋 白质芯片，对AIH、健康对照、以及其它需要和不需要进行鉴别诊断的血清样本进行检测，鉴定出在AIH样本中特异的RPS20自身抗原。专利技术人制备了 RPS20蛋白质，通过特异性蛋白质芯片和酶联免疫吸附试验 ((enzyme-1 inked immunosorbent assay，ELISA)方法，验证了其自身抗体可在部分 AIH 病人血清中检测到。单独检测时，检出率为40.0%-47. 70%。RPS20与其他5个自身抗原 一起，可联合检测AIH，特异性和敏感性分别为96. 2%和68. 2% (逻辑回归)及93. 2%和 84. 1% (判别分析)，准确率达到91. 7% (表1)。另外，RPS20可特异性地鉴别诊断PBC和 HC等其他肝脏疾病(图1)。因此，RPS20可作为AIH诊断的分子标志。具体地，本专利技术涉及以下几个方面1、一种人的RPS20蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中SEQ ID No 2的氨基酸残基序列；2)将序列表中SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基 的取代和/或缺失和/或添加且可识别针对序列表中SEQ IDNo 2的自身抗体的蛋白质序 列或可识别用序列表中SEQ ID No 2的序列表达的蛋白质所制备的抗体的蛋白质序列。2、项目1所述人的RPS20蛋白质的编码基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因1)序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；2)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID No 1的DNA序列具有85%以上同源性。3、含有项目1所述蛋白质的检测试剂，其用于检测人的自身免疫性肝炎。4、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的蛋白质芯 片检测试剂。5、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的ELISA检 测试剂。6、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的检测试 剂。7、使用项目1所述的蛋白质进行检测的方法，其包括使项目1所述的蛋白质与生 物样品接触。8、含有项目1所述蛋白质的抗体在自身免疫性肝炎中的应用。9、含有项目1所述蛋白质为药物靶标的应用。10、项目2所述的核酸分子的应用，其特征在于作为引物用于核酸扩增反应，或者 用于制造基因芯片或微阵列，或者用于作为自身免疫性肝炎诊断的标志。本专利技术的优点及有益效果(1)本专利技术RPS20具有极强的特异性，为特异的AIH标志物。(2)本专利技术克隆了其全长，具免疫反应的高特异性和高敏感性；其可以制备检测 AIH的试剂盒，检测效率高，使用方便，该试剂盒具有较高的应用价值。(3)本专利技术RPS20还可以作为治疗AIH药物研发的靶标。(4)本专利技术RPS20蛋白质及其核酸序列均可以作为AIH检测的靶标。附图说明图1是RPS20蛋白质与各组血清反应信号值的盒须图分析。将含有RPS20的蛋白质芯片检测包含自免肝、健康对照、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、丙肝(HC)、及其他疾病对 照共278份样品。长方形定义四分位距(IQR)；长方形内的横线表示中位值；长方形上下方 的误差棒定义了 1. 5IQR的离群值。所有1. 5*IQR+中位值之外的末端离群值点用黑色小方 块表示。结果显示RPS20可特异性地鉴别AIH与非AIH，包括需要与AIH鉴别诊断的PBC及 HC。具体实施例方式材料来源本专利技术具体实施方式所用血清标本来源于北京协和医院。留取的血液经沉淀离心 后，血清移入低温保存。疾病标本均经临床检验确诊，并有患者知情同意书。本具体实施方式所用试剂均为市售产品。实施例1RPS20自身抗原的制备以人肝脏cDNA文库为模板，根据RPS20基因序列设计特异引物，引物两端含有酵 母重组位点上游弓丨物5，gcatcaccatcaccatcacggtggtggtatggcttttaaggataccgg 3，(SEQID No 3)；下游弓丨物5，aggcagatcgtcagtcagtcacgatgaaagcatctgcaatggtgacttcc3，(SEQID No 4)。PCR(参数-MV 4min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C 2min，共 35 循环；72°C 10min，4°C 保存)扩增出全长RPS20基因，与线性载体pEGH(XbaI+HindIII双酶切)共同化学转化酵 母感受态细胞Y258(参考文献1)，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。筛选得到的 阳性克隆，用2%半乳糖诱导表达14小时。诱导后的酵母细胞裂解后，用GST亲和树脂纯化 蛋白(洗脱条件为30mM还原性谷胱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人的核糖体蛋白Ｓ２０蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：　　１）序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２的氨基酸残基序列；　　２）将序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且可与针对序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２的自身抗体识别的蛋白质的序列或可与用序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２表达的蛋白质制备的抗体识别的蛋白质的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋其峰，韩宇宁，刘国振，李永哲，朱衡，吴琳，
申请(专利权)人：北京华大蛋白质研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]