一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用，涉及蛋白质工程技术领域，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的葡萄糖脱氢酶突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第52位的精氨酸突变成天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变成丙氨酸，第228位的脯氨酸突变成丙氨酸，第241位的丝氨酸突变成谷氨酰胺，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比具有更高的热稳定性，野生型Tm值为63.74℃、突变体Tm值为79.3℃，较野生型增加了15℃，且突变体的辅酶也从无到有，其中NADP活性比野生型高出近6.5倍，NAD活性也比野生型高出3.4倍，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。供了良好的应用场景。供了良好的应用场景。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程
，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]葡萄糖脱氢酶gdh2是一类可以将葡萄糖催化成葡萄糖酸钙，同时还可以将NAD+或NAD(P+)为电子受体生成NAD(P)H的酶。NAD(P)H再生的许多氧化还原反应中，在工业生物催化制药前体的合成方面具有巨大的应用潜力。在工业生物催化制药过程中，对这些催化酶的稳定性和活性都有一定的要求，热稳定性好且活性高的生物催化酶，可以大大地降低生物催化制药的成本，提高催化效率。为了寻找热稳定性高的生物酶，一些耐热细菌为优选宿主，古菌以及一些嗜热菌因具有耐热性，其来源的生物酶通常也具有很好的耐热性和活性。硫磺矿硫化叶菌属于古菌，在进化上与嗜酸热硫化叶菌相近，因此具有潜在的耐热性。硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus zillig et al.)来源的gdh2，从其序列同源性上来看，属于葡萄糖脱氢酶，但是目前关于该酶的信息还不清楚。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术的首要目的在于提供一种高表达的葡萄糖脱氢酶突变体和应用。
[0004]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0005]本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]本专利技术提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述葡萄糖脱氢酶突变体。
[0007]进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述葡萄糖脱氢酶突变体的表达载体。
[0009]进一步改进在于，所述表达载体为pET
‑
28a。
[0010]本专利技术提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体表达系统，为转入上述重组质粒的大肠杆菌BL21。
[0011]本专利技术提供了一种上述葡萄糖脱氢酶突变体作为催化酶在工业生物催化制药过程中辅酶NADH及NADPH再生中的应用。
[0012]本专利技术提供了一种辅酶因子NAD(P)H的获得方法，以NAD(P+)为底物，利用上述葡萄糖脱氢酶突变体将NAD(P+)转化成NAD(P)H。
[0013]本专利技术具有如下有益效果：
[0014]本专利技术提供了一种以葡萄糖为底物的来源于硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus zillig et al.)的葡萄糖脱氢酶突变体，该突变体通过将葡萄糖脱氢酶蛋白序列的第52位的精氨酸突变为天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变为丙氨酸，第228位的脯氨酸突变为丙氨酸，第241位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，使其与野生型的葡萄糖脱氢酶相比
具有更高的热稳定性，野生型Tm值为63.74℃、突变体Tm值为79.3℃，较野生型增加了15℃，具有与嗜热菌相似的Tm值，为该酶在工业生物催化制药过程中的应用提供了良好的应用场景。
[0015]此外，本专利技术提供的葡萄糖脱氢酶突变体还具有氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生中的应用，野生型的gdh2未检测到明显的NADH和NADPH再生的活性，其突变体gdh2
‑
4M还原NADP+活性比野生型高6.5倍，还原NAD+活性比野生型高3.5倍。其突变体更适合NADH和NADPH再生中的应用，为工业生物催化制药过程NADH和NADPH的再生提供了更好的催化酶。
附图说明
[0016]图1为野生型gdh2及其突变体蛋白小量表达SDS
‑
PAGE检测结果；
[0017]图2为野生型gdh2及其突变体蛋白亲和纯化结果；
[0018]图3为野生型gdh2及其突变体蛋白热稳定性检测结果；
[0019]图4为野生型gdh2及其突变体蛋白再生NAD(P)H活性曲线；
[0020]图5为野生型gdh2及其突变体蛋白再生NAD(P)H活性参数。
具体实施方式
[0021]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
[0022]1、材料
[0023]本专利技术所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0024]2、方法
[0025]2.1重组质粒的构建及表达
[0026](1)野生型gdh2(氨基酸蛋白序列见SEQ ID NO.3)及gdh2突变体gdh2
‑
4M、gdh2
‑
6M(氨基酸蛋白序列见SEQ ID NO.4)的基因序列均是通过基因合成获得，表达载体为pET
‑
28a，重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致，gdh2突变体gdh2
‑
4M是在野生型gdh2的原始序列基础上将52位的精氨酸突变为天冬氨酸，第114位的甘氨酸突变为丙氨酸，第228位的脯氨酸突变为丙氨酸，第241位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，gdh2
‑
4M的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。gdh2突变体gdh2
‑
6M是在野生型gdh2的原始序列基础上将第52位的精氨酸突变成亮氨酸，第114位的甘氨酸突变成丙氨酸，第119位苏氨酸突变成异亮氨酸，第194位苏氨酸突变成异亮氨酸，第228位的脯氨酸突变成丙氨酸，第313脯氨酸突变为酪氨酸，gdh2
‑
6M的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0027]将野生型gdh2和gdh2突变体(gdh2
‑
4M和gdh2
‑
6M)两种类型的重组质粒分别按照常规分子生物学手段分别转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌斑至5mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600至0.6
‑
0.8时取少量菌液用loading buffer进行固定，并取少量菌液加入甘油冻至
‑
80℃，剩余菌液加入0.5mM IPTG诱导4个小时后，收集菌体
并取诱导后菌液进行SDS
‑
PAGE检测。根据SDS
‑
PAGE结果可知，野生型gdh2和gdh2突变体(gdh2
‑
4M和gdh2
‑
6M)在BL21(DE3)大肠杆菌中均明显表达(图1)。
[0028](2)诱导表达融合蛋白：将上述明显表达的菌株分别接种至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体。3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为含有如权利要求2
‑
3任一所述的多核苷酸且能够翻译表达出如权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体的表达载体。5.根据权利要求4所述的一种重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，陈倩，桂文君，王俊超，邵志鹏，
申请(专利权)人：无锡佰翱得生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：