一种基于LAMP-CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于LAMP

【技术实现步骤摘要】
一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物基因
，尤其涉及一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为圆环病毒科成员。PCV1是1974年从猪肾上皮细胞(PK
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15)中分离出来的非致病性病毒粒子。PCV2为引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的主要病原，具有较强的致病性，可致宿主机体的免疫抑制，造成免疫功能低下，临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍和呼吸及消化系统疾病。2016年10月，美国堪萨斯州立大学的Palinski R等借助宏基因组测序技术从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出PCV3，证实美国多个州猪群存在PCV3感染。随后,波兰、意大利、韩国等国家相继检测出PCV3。虽然目前关于PCV3致病作用的证据较为匮乏,但普遍认为与PDNS、繁殖障碍和多系统炎症存在潜在关联。2019年4月,在中国湖南省的几只临床疾病严重的猪身上发现了一种与其他圆环病毒有明显亲缘关系的新型圆环病毒，并命名为PCV4。
[0003]PCV2引起的综合征给养猪业造成了巨大损失，因此有必要开发一种临床简便检测PCV2的有效方法来预防这些疾病。目前已经开发了许多检测这种病毒的方法，但大都需要专业设备和人员才可进行检测，缺乏偏远地区临床检测的机动性，因此仍然需要一种快速、灵敏和易于操作的方法，特别是对于PCV2的检查。

技术实现思路

[0004]1.要解决的技术问题
[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术中PCV2引起的综合征给养猪业造成了巨大损失的问题，而提出的一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法。
[0006]2.技术方案
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0008]一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：
[0009]步骤1：组织样品的处理
[0010]将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；
[0011]步骤2：病毒DNA的提取
[0012]步骤3：引物设计
[0013]在GenBank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过Meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用Primer Premier 5软件，设计
ORF2基因的全长引物；以高度保守片段ORF2基因，运用在线生物网站PrimerExplorer V5(https://primerexplorer.jp/)设计4条计特异性的LAMP扩增引物；猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用CRISPR
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DT引物设计网站设计猪圆环病毒2型ORF2基因的crRNA引物和探针，并委托某生物有限公司合成；
[0014]根据GenBank中检索的多株猪圆环病毒2型参考序列使用Primer Premier 5软件设计ORF2基因引物，进行PCR扩增，PCR体系为50μL，其中Mix 25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板3μL，灭菌水20μL；
[0015]步骤4：PCR产物回收及纯化
[0016]根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用，置于
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20℃保存；
[0017]步骤5：标准质粒的构建
[0018]根据某公司的pMDTM19T Vector Cloning Kit使用说明书，构pMD
TM
18T
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ORF2重组质粒；
[0019]步骤6：重组质粒鉴定
[0020]取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与Cap基因全长进行比对分析；
[0021]步骤7：质粒DNA小量抽提
[0022]根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMD
TM
18
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ORF2重组质粒备用；
[0023]步骤8：LAMP引物筛选
[0024]根据LAMP核酸扩增试剂盒说明扩增猪圆环2型，筛选出最佳LAMP引物；
[0025]步骤9：猪圆环病毒2型LAMP
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CRISPR/Cas12a检测体系建立
[0026]最佳浓度筛选：设置LbCas12a蛋白浓度分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM，设置crRNA浓度设置分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比
[0027]crRNA筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crRNA引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；
[0028]灵敏度试验；
[0029]特异性试验；
[0030]重复性检验：选择105～103copies/μL的稀释质粒，利用已确定的最佳检测体系进行3次重复，并于不同时间点再重复检测，以确定该方法的重复性；
[0031]临床样本检测：根据DNA提取方法进行对临床样本进行DNA的提取，与LAMP基础型核酸扩增试剂相结合，使用Primer Premier 5软件，设计Cap基因的ERA引物，采用本研究建立的CRISPR Cas12a方法对15份样本进行PCV4的检测，同时，使用qPCR技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价CRISPR技术的临床应用的实用价值。
[0032]3.有益效果
[0033]相比于现有技术，本专利技术的优点在于：
[0034]本专利技术中，在CRISPR技术的基础上与LAMP技术相结合，建立了PCV2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要
复杂的仪器设备、对于冷链运输和非专业人员，即使在偏远地区也能对疫病进行实时监测，为PCV2的流行病学的调查，掌握传播规律以及疫病的防控提供技术支持。
附图说明
[0035]图1为本专利技术中提出的PCV2 ORF2引物表；
[0036]图2为本专利技术中提出的PCV2 LAMP引物表；
[0037]图3为本专利技术中提出的PCV2 crRNA引物表；
[0038]图4为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：步骤1：组织样品的处理，将称取约1g的各组织样品，加入1mL PBS后放入组织研磨器中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min，吸取上清用于后续病毒核酸的提取；步骤2：病毒DNA的提取；步骤3：引物设计，在GenBank中检索多株猪圆环病毒2型全基因组序列，通过Meglign软件分析比对，确定猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用Primer Premier 5软件，设计ORF2基因的全长引物；以高度保守片段ORF2基因，运用在线生物网站PrimerExplorer V5(https://primerexplorer.jp/)设计4条计特异性的LAMP扩增引物；猪圆环病毒2型全基因组中高度保守片段ORF2基因，使用CRISPR
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DT引物设计网站设计猪圆环病毒2型ORF2基因的crRNA引物和探针，并委托某生物有限公司合成；步骤4：PCR产物回收及纯化，根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用，置于
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20℃保存；步骤5：标准质粒的构建，根据某公司的pMDTM19T Vector Cloning Kit使用说明书，构pMD
TM
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ORF2重组质粒；步骤6：重组质粒鉴定，取部分培养菌液，委托北京某生物科技有限公司进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与Cap基因全长进行比对分析；步骤7：质粒DNA小量抽提，根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMD
TM
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ORF2重组质粒备用；步骤8：LAMP引物筛选，根据LAMP核酸扩增试剂盒说明扩增猪圆环2型，筛选出最佳LAMP引物；步骤9：猪圆环病毒2型LAMP
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CRISPR/Cas12a检测体系建立；最佳浓度筛选：设置LbCas12a蛋白浓度分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM，设置crRNA浓度设置分别为25nM、50nM、100nM、150nM、200nM进行正交试验，筛选出最佳的反应浓度比crRNA筛选：对设计的五对猪圆环病毒2型crRNA引物进行筛选，加样完成后置于37℃孵育50min，在紫外灯下观察，筛选出最优引物用于后续试验；灵敏度试验；特异性试验；重复性检验：选择105～103copies/μL的稀释质粒，利用已确定的最佳检测体系进行3次重复，并于不同时间点再重复检测，以确定该方法的重复性；临床样本检测：根据DNA提取方法进行对临床样本进行DNA的提取，与LAMP基础型核酸扩增试剂相结合，使用Primer Premier 5软件，设计Cap基因的ERA引物，采用本研究建立的CRISPR Cas12a方法对15份样本进行PCV4的检测，同时，使用qPCR技术检测方法平行检测，比较两者的检出率情况，评价CRISPR技术的临床应用的实用价值。2.根据权利要求1所述的一种基于LAMP
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CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，其特征在于，所述病毒DNA的提取包括以下操作步骤：S1、用移液器将20ul proteinase K加入一个干净的1.5ml离心管；S2、向离心管中加入200ul血清；
S3、加入200ulCarrier RNA工作液，盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀；S4、在56℃孵育15min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；S5、加入500ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀，盖上管盖并涡旋振荡15sec，彻底混匀；S6、在室温下15～25℃放置5min，简短离心以收集附着在管壁及管盖上的液体；S7、仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase
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Free吸附柱CR2，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；S8、小心打开吸附柱盖子，加入500ul缓冲液GD，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；S9、小心打开吸附柱盖子，加入600ul漂洗液PW，盖上管盖，静置2min，8000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；S10、重复步骤9；S11、小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，8000rpm离心1min，弃废液；S12、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全边干，弃废液；S13、将吸附柱放入一个RNase
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Free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3min，使吸附膜完全变干，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～70ul RNase
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘永杰，毛首会，兰喜，马维民，杨亚民，吕律，吴锦艳，张伟，何继军，尚佑军，郑海学，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：