基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法技术

本发明专利技术公开了基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法。表达载体包含SV40启动子控制的海参荧光素酶Rluc基因表达框，以及FAP启动子控制的萤火虫荧光素酶Fluc基因表达框。该方法所采用的表达载体基于FAP启动子调控的Fluc表达而建立，以MCFs或HCFs为宿主，通过转化，或基于表达载体构建的慢病毒或腺病毒通过感染MCFs或HCFs而构建得到细胞模型；该细胞模型采用FAP启动子，以Fluc作为报告基因，同时以SV40启动子控制下Rluc的组成型表达作为内参；本发明专利技术首次采用心肌纤维化生物标志基因FAP的启动子构建抗心肌纤维化药物筛选方法，能够高度特异性反应心肌纤维化的病理生理变化，同时采用双荧光素酶方法检测，赋予该检测方法简便、可定量、高灵敏度及背景低等特点。高灵敏度及背景低等特点。高灵敏度及背景低等特点。

【技术实现步骤摘要】
基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物医药工程
，特别是一种基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法。

技术介绍

[0002]胞外基质蛋白在心肌间质的累积与交联在维持心脏正常形态结构及功能中发挥重要作用，但是其过度的累积与高度的交联促进心肌纤维化，导致心脏形态结构重塑，舒张功能障碍，是引起心衰的重要诱因，因其发病率及致死率极高，严重危害人们身心健康。心肌纤维化是各种心肌病发展早期的重要病理特征，也是最终发展为心衰的重要诱因，因此，抗心肌纤维化是改善各种心肌病的关键防治策略之一，目前临床药物仅能延缓心肌纤维化进程，治疗效果非常有限，联合用药的同时也带来一定副作用。因此，进一步开发新的心肌纤维化防治药物显得尤为重要。在药物开发过程中，一种简单、重复性好、能够高通量的药物筛选平台与方法是获得抗心肌纤维化药物的关键。
[0003]纤维素活化蛋白(fibroblast activation protein，FAP)是一种膜整合性丝氨酸肽酶，含有两个具有大的C末端胞外域的N
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糖基化亚基，具有二肽基肽酶和内肽酶活性，可裂解明胶和I型胶原，控制胶原蛋白完整性，也是ECM的加工酶，是纤维化的关键调控因子。通常，FAP在正常人组织表达量非常低，几乎不能被检测到，但是，在纤维化过程中，重构组织活化的肌成纤维细胞中能够选择性诱导表达FAP。在组织压力或损伤应答中，如局部炎症，伤口愈合，癌症溶器官移植，修复机制可能引起两种不同的结果：一种是损伤组织的正常再生过程，涉及瞬时纤维化，损伤组织和细胞能够被正常细胞所代替来维持正常组织稳态，FAP在该过程中短暂表达，随着组织的修复而逐渐处于抑制状态；而另一种病理性慢性、不可控纤维化，其中活化的肌成纤维细胞和炎症细胞将永久取代正常组织，而活化的肌成纤维细胞是FAP的重要来源，同时也是胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白或二肽基肽酶IV(DPP
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IV/CD26)蛋白酶家族的丝氨酸肽酶的重要分泌细胞。因此，FAP被认为是一种肌成纤维细胞活化标志物，即纤维化病理特征的重要标志物。
[0004]大量研究表明，FAP在人组织表达具有高度特异性，主要由分布于心肌纤维化组织或肿瘤纤维化组织或伤口愈合纤维化部位肌成纤维细胞表达分泌而来。通常，伤口愈合过程中，FAP有短期表达，修复愈合后FAP表达水平下降至难以检测，但是在长期压力诱导下的心脏损伤出FAP能够得到持续高水平表达，具有高度特异性。目前已有研究数据显示FAP的表达可以作为以高度纤维化为特征的肿瘤标志物用于肿瘤正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)检测(Schmidkonz C,et al.J Nucl Med.2022,63(12):1786
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1792；Jin X,et al.JNucl Med,2022,63(2):212
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217)，心脏正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)检测检测(Wang X,et al.JACC Cardiovac Imaging,2022,15(11):1960
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1970)，心脏磁共振显像(cardiac magnetic resonance,CMR)检测(Diekmann J,et al.J Nucl Med,2022,63(9):1415
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1423)，甚至成为肿瘤靶向治疗的重要靶点(Bionapally S,et al.Eur J Nucl Med Mol Imaging,2022,49(13):4369
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4381)，近期在Nature(Aghajanian et al.Nature,2019,573(7774):430
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433)及Science(Rurik et al.Science,2022,375:91
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96)等期刊文章阐述以FAP作为靶点的心肌纤维化靶向治疗，效果显著，具有非常好的治疗潜能。
[0005]综上所述，FAP是纤维化相关病理变化重要的标志基因。本专利技术基于FAP在纤维化组织特异性表达这一特点，构建FAP启动子调控的Fluc报告基因表达的抗心肌纤维化药物筛选方法，同时采用SV40启动子控制的Rluc报告基因作为内参，进一步优化了筛选数据的可靠性，可操作用。而目前已有抗心肌纤维化药物筛选方法是基于特异性心肌纤维化病理基因模块以及构建具有转录组学数据的药物数据集，然后根据基因表达推演法预测对应药物的抗心肌纤维化能力，该过程操作繁琐，工作量大，分析过程复杂，效率低。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法，以解决上述技术背景中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0008]第一方面的，本专利技术提供了一种基于FAP启动子的表达载体，该表达载体，包含SV40启动子控制的海参荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)基因表达框，以及FAP启动子控制的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)基因表达框。
[0009]所述表达载体中SV40启动子控制Rluc报告基因的表达，其中SV40启动子核酸序列如SEQ ID NO:1所示，Rluc报告基因核酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0010]所述表达载体中FAP启动子控制Fluc报告基因的表达，其中FAP启动子核酸序列如SEQ ID NO:3所示，Fluc基因核酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0011]上述技术方案中，所述表达载体的构建方法为：
[0012](1)先通过PCR方法将质粒psiCHECK2上的Synthetic poly(A)与FAP启动子拼接形成Synthetic poly(A)
‑
FAP Promoter融合片段，5
’
端为Not I限制性内切酶识别位点，3
’
端为Apa I限制性内切酶识别位点；
[0013](2)将载体psiCHECK2通过Not I/Apa I双酶切线性化之后，琼脂糖凝胶电泳回收大片段，在T4 DNA连接酶作用下与步骤(1)所得的Synthetic poly(A)
‑
FAP Promoter融合片段片段链接，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并测序鉴定，即获得表达载体psiCHECK2
‑
FAP
‑
Promoter
‑
Fluc。
[0014]上述技术方案中，所述表达载体以SV40启动子控制下Rluc作为内参报告基因，FAP启动子控制下Fluc作为报告基因，用于评价药物对FAP活性的影响。
[0015]上述技术方案中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于FAP启动子的表达载体，其特征在于，该表达载体，包含SV40启动子控制的海参荧光素酶（renilla luciferase,Rluc）基因表达框，以及FAP启动子控制的萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase,Fluc）基因表达框。2.根据权利要求1所述的基于FAP启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法为：（1）先通过PCR方法将载体psiCHECK2上的Synthetic poly(A)与FAP启动子拼接形成Synthetic poly(A)
‑
FAP Promoter融合片段，5
’
端为Not I限制性内切酶识别位点，3
’
端为Apa I限制性内切酶识别位点；（2）将载体psiCHECK2通过Not I/Apa I双酶切线性化之后，琼脂糖凝胶电泳回收大片段，在T4DNA连接酶作用下与步骤（1）所得的Synthetic poly(A)
‑
FAP Promoter融合片段连接，转化DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆并测序鉴定，即获得表达载体psiCHECK2
‑
FAP
‑
Promoter
‑
Fluc，命名为pSV40P
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Rluc
‑
FAPP
‑
Fluc。3.根据权利要求1所述的基于FAP启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体以SV40启动子控制下Rluc作为内参报告基因，FAP启动子控制下Fluc作为报告基因，用于评价药物对FAP启动子活性的影响。4.根据权利要求1所述的基于FAP启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过转染细胞获得基因工程细胞株；或者所述表达载体中SV40启动子控制的Rluc基因和FAP启动子控制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓松，周驰，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：