本发明专利技术公开了鲁米诺直接键合的纳米金在免疫分析中的应用。其一是鲁米诺直接键合的纳米金免疫分析探针，该分析探针由鲁米诺直接键合的纳米金标记的抗体所组成。其中，鲁米诺直接键合的纳米金是由鲁米诺一步还原氯金酸得到的。其二是基于该鲁米诺直接键合的纳米金免疫分析探针的化学发光免疫分析方法。其三是实施该分析方法的试剂盒。本发明专利技术的化学发光免疫分析方法具有灵敏度高（如测定人ＩｇＧ的检测限可达１．０ｐｇ／ｍＬ）、线性范围宽、重现性好、操作简单、成本低廉等优点，可用于各种样品中的多种分析物的测定。在临床诊断与治疗、药物分析、食品安全检测、环境监测等领域具有重要的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鲁米诺直接键合的纳米金的应用，特别涉及其在免疫分析中的应用。
技术介绍
化学发光是化学反应过程中产生的光发射现象。作为一种光学检测手段，它不 需要光源，具有灵敏度高、线性范围宽、背景噪声小、仪器简单、价格便宜等优点，已被广泛 用于免疫分析中(Wu，A. H. B. Clin. Chim. Acta 2006,369,119 ；Zhan, W. ；Bard, A. J. Anal. Chem. 2007, 79,459 ；Yin, Χ. B. ；Qi, B. ；Sun ；Χ. P. ；Yang ；X. R. ；Wang ；Ε. K. Anal. Chem. 2004, 77, 3525 ；Jie, G. F. ；Huang, H. P. ；Sun, Χ. 1. ；Zhu, J. J. Biosens. Bioelectron. 2008, 23, 1896 ；Egashira, N. ；Morita, S. ；Hifumi, Ε. ；Mitoma, Y. ；Uda, Τ.Anal. Chem. 2008,80, 4020)，目前已经成为许多大医院的主要临床分析手段之一。各种化学发光免疫分析方法的 性能很大程度上取决于所采用的探针。现有商业化的化学发光分析探针主要包括以下两 类(a)化学发光分子如异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯和联吡啶钌等。采用发光分子作为 探针，不仅需要缩合反应将发光分子与生物分子结合，还需要对缩合反应后的产物进行纯 化，操作过程十分复杂、耗时。(b)酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶等。利用酶分子对特定化 学发光反应的催化作用，建立了一系列酶促化学发光生物分析方法。这类方法的主要问题 是酶分子容易失活，影响分析的稳定性。此外，上述以发光分子和酶作为探针的分析技术还 存在下列一些缺陷，比如分析成本高，难以进行低含量组分的检测，难以进行快速、现场的 分析。近年来，由于纳米材料独特的生物相容性、表面特性和化学发光特性，人们开始尝 试将纳米材料作为探针应用于化学发光免疫分析中。纳米金由于其良好的稳定性和生物兼 容性已被用作化学发光免疫分析的探针。2005年，Lu研究小组和Li研究小组各自建立了 纳米金标记的“溶出”化学发光免疫分析方法，其原理均是在免疫反应后将纳米金氧化溶解 为三价金离子Au(III)，然后利用Au(III)对鲁米诺化学发光体系的催化或氧化作用进行 检测(Fan，A.P. ； Lau, C. W. ；Lu, J. Z. Anal. Chem. 2005, 77, 3238 ；Li, Ζ. F. ；Wang, Y. C. ；Liu, C. H. ；Li, Y. K. Anal. Chim. Acta 2005，551，85)。这种方法的主要缺陷在于溶解氧化纳米金 需要十分苛刻的实验条件(如高浓度的HNO3-HCl,或者有毒的HBr-Br2)，导致较高的背景 化学发光。之后，两个研究小组相继报道了以纳米金直接作为催化型探针的免疫分析方法 (Wang, Ζ. P. ；Hu, J. Q. Jin, Y. ；Yao, X. ；Li, J. H. Clin. Chem. 2006, 52,1958 ；Duan, C. F.； Yu, Y. Q. ；Cui，H. Analyst 2008，133，1250)，利用纳米金对化学发光反应的催化作用直接进 行发光检测，避免了“溶出”过程。Li研究小组利用不规则纳米金对鲁米诺-过氧化氢体系 化学发光的增强作用进行直接测定。虽然这种方法避免了苛刻的溶出过程，但是，这种不规 则纳米金的合成难以控制，需要长时间恒温反应(40°C，24h)和除氧操作，同时合成的纳米 金单分散性差，影响批次之间的重现性，限制了该方法的实际应用。Duan等人研究发现，粒 径为8 68nm的普通球状纳米金能够诱导鲁米诺-硝酸银体系在425nm处产生快速的强 光发射(Duan，C. F. ；Yu, Y. Q. ；Cui, H. Analyst 2008，133，1250)。在此基础上，将常规的柠檬酸盐保护的纳米金粒子作为免疫分析的探针，利用纳米金对鲁米诺-硝酸银化学发光反 应的催化作用，建立了一种测定人体IgG的微孔板化学发光免疫分析新方法。与已经报道 的基于纳米金的化学发光免疫分析方法相比，该方法避免了苛刻的溶出过程，避免了不规 则纳米金的合成，提高了该化学发光免疫分析方法在临床诊断中的可用性。但是上述基于 纳米金的化学发光免疫分析方法，其检测限为0. 5-100ng/mL IgG，分析灵敏度有待提高。并 且发光试剂仍需免疫反应后单独引入，因此在免疫分析的应用中具有一定的局限性。因此， 开发能够克服上述缺陷的新型免疫分析探针和化学发光免疫分析新技术是十分必要的。鲁米诺(luminol)，又名发光氨。化学名称为3_氨基邻苯二甲酰胼，化学式为 C8H7N3O2。常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，是一种比较稳定的人工合成的有机化合 物。它结构简单、易于合成、水溶性好，是目前应用最广泛的化学发光试剂之一。鲁米诺分子 本身并不适合直接作为免疫分析的探针，因为利用其芳香胺基团标记抗原或抗体分子后， 空间位阻增大，发光效率降低。但鲁米诺常作为发光底物，应用于酶标记的化学发光酶免疫 分析中。最近，文献报道可将鲁米诺通过化学反应键合到纳米金的表面形成鲁米诺键合 的纳米金(Cui，H. ；Wang，W. ；Duan, C. F. ；Dong, Y. P. ；Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007，13， 6975 ；Roux, S. ；Garcia, B. ；Bridot, J. L. ；Salom, Marquette, C. Langmuir. 2005,21, 2526)，并发现这些鲁米诺键合的纳米金具有电致化学发光活性，但其在生物分析中的应用 尚T^ff 胃。2005 ￥， Roux ^A (Roux, S. ；Garcia, B. ；Bridot, J. L. ；Salom, Marquette, C. Langmuir. 2005，21，2526)用二氢硫辛酸作为保护试剂，硼氢化钠(NaBH4)还原氯金酸 (HAuCl4. 3H20)合成了二氢硫辛酸保护的纳米金。利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳 化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化纳米金表面的二氢硫辛酸的羧基，然后通 过鲁米诺的-NH2和二氢硫辛酸的-COOH进行缩合反应将鲁米诺嫁接到纳米金的表面。这 个过程需要多步反应、沉淀洗涤、减压蒸馏、过滤、分散等多个步骤才能完成，非常麻烦、耗 时。研究结果表明通过二氢硫辛酸键合到纳米金表面的鲁米诺仍具有较好电致化学发光活 性。但是其是否能连接到生物分子上如蛋白质和DNA分子，以及连接生物分子后其复合物 的化学发光与电致化学发光活性尚未进行研究。用该方法所得到的鲁米诺键合的纳米金， 其表面大部分被二氢硫辛酸分子和鲁米诺分子所覆盖，我们推测通过纳米金表面和鲁米诺 分子直接连接蛋白质和DNA分子将是困难的。而通过二氢硫辛酸连接蛋白质和DNA分子 的量将是非常有限的。因为大部分二氢硫辛酸活性位点已被鲁米诺和纳米金占据，而且连 接后很难保本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鲁米诺直接键合的纳米金免疫分析探针。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔华，田大勇，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34
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