一种基于CRISPR-Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器及检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器及检测方法


[0001]本专利技术涉及RNA检测
，具体为一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器及检测方法。

技术介绍

[0002]肿瘤作为一种致死率高的疾病，早期诊断的及时发现是提高生存率和治疗效果的关键。因此，液体活检作为一种有前景的早期诊断方法，通过检测循环肿瘤DNA(ctDNA)、miRNAs、循环肿瘤细胞(CTCs)、外泌体等被广泛研究。
[0003]其中，外泌体是细胞分泌的一种具有膜结构的囊泡，大小为30
‑
150nm，其通常在多泡体(MVBs)中产生，并通过MVBs与细胞膜的融合分泌到细胞外液中。大量的研究表明，含有母细胞来源的蛋白质、脂类和核酸的外泌体在细胞间的交流中起着重要作用，并具有作为肿瘤诊断体液活检标志物的巨大潜力。这主要是因为其成分不仅可以反映原癌细胞遗传信息等的改变，还可以在体液中稳定存在并具有高的浓度(≥109/mL)。因此，相对于其它的液体活检标志物，外泌体也具有很大的优势。
[0004]目前，外泌体中发现的潜在标志物主要包括蛋白质、RNA(microRNA、lnc
‑
RNA、mRNA)和DNA(dsDNA、mtDNA、ssDNA)。其中，microRNA是RNA中较易检测的靶标，且已有多种microRNA被认为与肿瘤的发生发展相关，如microR
‑
21、microR
‑
141、microR
‑
200a、microR
‑
203、microR
‑
205和microR
‑
214等。
[0005]目前，现有的外泌体中microRNA的检测方法大多是针对外泌体中单一的microRNA，无法同时检测种类较多的microRNA。由于与肿瘤发展相关的microRNA种类较多，单一microRNA的检测结果不够全面，可能会降低其对肿瘤诊断的精确度和准确性。这就需要对每种相关的microRNA均进行定量检测，然而，按现有技术的检测方法，每检测一种microRNA，需要按照相关检测方法流程重新操作一次，整体的检测效率不高，另外，其检测灵敏度和准确性也相对较低。
[0006]如：中国专利技术专利(授权公告号：CN105063209B，授权公告日：2017.12.12)公开了一种外泌体miRNA的定量检测方法，该专利技术方法是基于特异性的唯一标签接头的标记，对每个原始模板进行区分，避免了扩增时分子间存在的偏好性，可以精确检测低于10拷贝以下的miRNA分子，且特异性高，可用于肿瘤源性的外泌体miRNA的检测，神经退行性疾病、心血管疾病，生育健康等领域的检测，可为疾病的早期筛查提供依据。
[0007]但是，该检测方法在检测过程中还需要依赖miRNA文库的筛选以及计算机算法的纠错等步骤，最终的检测结果准确度取决于算法的优劣，且无法进行现场检测，在检测便捷度和检测结果的准确性上还有待提高。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传
感器及检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器，包括：
[0011]sgRNA复合物，所述的sgRNA复合物通过纳米材料、3
’
端修饰有生物素的复合物活性抑制探针(blocker探针)、CRISPR
‑
Cas9系统中的sgRNA之间的反应构建形成；
[0012]识别探针(trigger探针)，所述的识别探针(trigger探针)用于与脱氧核苷酸(dNTPs)、聚合酶和外切酶(Nb.BbvCI)配合，构建形成杂交反应体系，在杂交反应体系中，识别探针(trigger探针)与标准品外泌体中释放的特定microRNA进行杂交，并在脱氧核苷酸(dNTPs)、聚合酶和外切酶(Nb.BbvCI)的作用下，循环引发产生对应的信号核酸序列(produceDNA)，信号核酸序列(produceDNA)与所述的sgRNA复合物反应后，释放sgRNA，分离出的sgRNA与Cas9蛋白结合，形成sgRNA最终复合物；
[0013]结合有荧光染料的靶标双链DNA，所述的靶标双链DNA用于与sgRNA最终复合物反应，生成附着有荧光染料的上清液，基于上清液的荧光值，建立荧光值与标准品外泌体中microRNA含量的相关线性曲线。
[0014]作为本专利技术进一步的方案，所述的复合物活性抑制探针(blocker探针)具有用于与sgRNA的部分核酸序列进行互补的活性抑制核酸序列，且所述的活性抑制核酸序列还用于与引发产生的信号核酸序列(produceDNA)进行互补。
[0015]作为本专利技术进一步的方案，所述的识别探针(trigger探针)包括microRNA识别核酸序列、外切酶识别核酸序列以及信号引发核酸序列；
[0016]所述的microRNA识别核酸序列用于识别外泌体中释放的特定microRN A，并与其进行互补；
[0017]所述的信号引发核酸序列用于引发生成与其互补的信号核酸序列(produ ceDNA)。
[0018]作为本专利技术进一步的方案，所述特定microRNA包括但不限于microRNA
‑
21、microRNA
‑
141、microRNA
‑
155、microRNA
‑
200a、microRNA
‑
203、mic roRNA
‑
205、microRNA
‑
210、microRNA
‑
214。
[0019]作为本专利技术进一步的方案，所述的纳米材料采用纳米磁珠。
[0020]一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测方法，包括如下步骤：
[0021]S1、sgRNA复合物的制备：首先，将CRISPR
‑
Cas9系统中的sgRNA和3
’
端修饰有生物素的复合物活性抑制探针(blocker探针)在室温下杂交28
‑
32min；
[0022]然后，将其与修饰有链霉亲和素的纳米磁珠进行反应，使之形成sgRNA复合物；
[0023]S2、结合有荧光染料的靶标双链DNA的制备：首先，采用PCR技术，通过正向引物将生物素修饰在靶标双链DNA上，同时，通过物理吸附将链霉亲和素修饰在载具的表面；
[0024]然后，通过链霉亲和素与生物素的相互作用，将上述修饰有生物素的靶标双链D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器，其特征在于：包括：sgRNA复合物，所述的sgRNA复合物通过纳米材料、3
’
端修饰有生物素的复合物活性抑制探针、CRISPR
‑
Cas9系统中的sgRNA之间的反应构建形成；识别探针，所述的识别探针用于与脱氧核苷酸、聚合酶和外切酶配合，构建形成杂交反应体系，在杂交反应体系中，识别探针与标准品外泌体中释放的特定microRNA进行杂交，并在脱氧核苷酸、聚合酶和外切酶的作用下，循环引发产生对应的信号核酸序列，信号核酸序列与所述的sgRNA复合物反应后，释放sgRNA，分离出的sgRNA与Cas9蛋白结合，形成sgRNA最终复合物；结合有荧光染料的靶标双链DNA，所述的靶标双链DNA用于与sgRNA最终复合物反应，生成附着有荧光染料的上清液，基于上清液的荧光值，建立荧光值与标准品外泌体中microRNA含量的相关线性曲线。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器，其特征在于：所述的复合物活性抑制探针具有用于与sgRNA的部分核酸序列进行互补的活性抑制核酸序列，且所述的活性抑制核酸序列还用于与引发产生的信号核酸序列进行互补。3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器，其特征在于：所述的识别探针包括microRNA识别核酸序列、外切酶识别核酸序列以及信号引发核酸序列；所述的microRNA识别核酸序列用于识别外泌体中释放的特定microRN A，并与其进行互补；所述的信号引发核酸序列用于引发生成与其互补的信号核酸序列。4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPR
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Cas9系统的外泌体microRN A检测生物传感器，其特征在于：所述特定microRNA包括但不限于microR NA
‑
21、microRNA
‑
141、microRNA
‑
155、microRNA
‑
200a、microRNA
‑
203、microRNA
‑
205、microRNA
‑
210、microRNA
‑
214。5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR
‑
Cas9系统的外泌体microRNA检测生物传感器，其特征在于：所述的纳米材料采用纳米磁珠。6.一种基于CRISPR
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Cas9系统的外泌体microRNA检测方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、sgRNA复合物的制备：首先，将CRISPR
‑
Cas9系统中的sgRNA和3
’
端修饰有生物素的复合物活性抑制探针在室温下杂交28
‑
32min；然后，将其与修饰有链霉亲和素的纳米磁珠进行反应，使之形成sgRNA复合物；S2、结合有荧光染料的靶标双链DNA的制备：首先，采用PCR技术，通过正向引物将生物素修饰在靶标双链DNA上，同时，通过物理吸附将链霉亲和素修饰在载具的表面；然后，通过链霉亲和素与生物素的相互作用，将上述修饰有生物素的靶标双链DNA固定在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄琳，周梦洋，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：