醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶及在他汀类药物手性中间体连续流合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醛酮还原酶

【技术实现步骤摘要】
醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶及在他汀类药物手性中间体连续流合成中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种6
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氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯的制备方法，特别涉及一种基于功能化树脂固定化酶填充的循环式连续流反应器高效绿色生产6
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氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯的方法。
(二)
技术介绍

[0002]阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂功效、长期安全性和临床益处，显著降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。血浆中胆固醇的正常含量为0
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200mg/dL，当LDL胆固醇浓度升高沉积于心脑部位血管动脉内壁，导致动脉粥样硬化性斑块，从而引发心血管疾病。而他汀类药物能够作为胆固醇合成限速酶的竞争性抑制剂，降低血液中低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)胆固醇水平。在降低心脑血管疾病发生率及抗氧化、消炎、抗癌，预防中风和老年痴呆症等方面也得到了广泛研究应用。
[0003]6‑
氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯、6
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氯
‑
(3R,5S)
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二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀合成的关键手性中间体。由于6
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取代
‑r/>(3R,5R/S)
‑
二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，因此，研究光学纯6
‑
取代
‑
(3R,5R/S)
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二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。化学法合成6
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氰基
‑
(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯反应条件较为苛刻，其第二个手性中心的合成，需要在超低温
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90℃条件下，二异丙基胺基锂(LDA)脱质子缩合，硼烷作为手性诱导剂，硼氢化钠作为还原剂进行反应。该反应存在选择性不强，产物光学纯度低，能耗大、成本高、环境不友好等问题。而生物催化合成6
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氰基
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(3R,5R)
‑
二羟基己酸叔丁酯，具有原子利用率高，区域/立体选择性高，反应条件温和，有机试剂用量少，安全绿色等优势，可避免化学法的多步保护与去保护步骤。
[0004]现有生物催化合成6
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氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯反应体系主要包括醛酮还原酶偶联葡萄糖脱氢酶双酶双底物体系以及羰基还原酶偶联辅底物异丙醇的单酶双底物体系，而目前主要是通过全细胞或游离酶构筑的酶
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偶联与底物
‑
偶联体系来实现6
‑
氰基
‑
(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯的不对称还原合成。
[0005]而采用游离细胞或者酶作为催化剂，游离细胞或者酶的稳定性较差，易变性失活；细胞或者酶只能一次性使用，增加了酶制剂成本与废水、废渣排放；酶与底物和产物的混合加大了产物的分离纯化的难度，影响产品收率，增加生产成本。而酶固定化技术因其稳定性高、与反应混合物分离简单、可回收性强等优点，可解决上述问题。但是，将第一代热点材料(硅藻土、树脂、多孔玻璃、多糖类材料等)作为固定化酶的基质，普遍存在回收率和稳定性不高等缺点。
[0006]因此，设计理想的固定化方案，筛选合适的具备工业属性的固定化材料，采用静电吸附的方法，为提高醛酮还原酶固定化酶的稳定性及酶活回收率，自动化、高效连续式生产6
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氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯，成为酶法合成他汀类药物关键手性中间体的瓶颈。
7.0、20mM磷酸钠缓冲液)洗脱目的蛋白并收集后置于冰上保存，再用50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析(透析袋的截留分子量为10kDa)12h，收集截留液，即为醛酮还原酶纯酶液。
[0015]所述葡萄糖脱氢酶纯酶液制备步骤和醛酮还原酶纯酶液的步骤相同，葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]优选的，所述共固定化酶按以下方法制备获得：
[0017](1)戊二醛修饰氨基树脂
[0018]将氨基树脂加入含体积浓度0.5
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2％的戊二醛的磷酸钠缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，37℃搅拌1h对氨基树脂进行活化，然后用0.2M，pH 7.0磷酸钠缓冲液冲洗树脂去掉未反应的戊二醛，获得戊二醛修饰的氨基树脂；
[0019](2)葡萄糖脱氢酶的固定化
[0020]将葡萄糖脱氢酶BmGDH纯酶液添加到步骤(1)戊二醛修饰的氨基树脂中，在28℃、200rpm下孵育3小时，用0.2M、pH 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤后，获得葡萄糖脱氢酶
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树脂固定化复合物；
[0021](3)PEI修饰
[0022]将步骤(2)葡萄糖脱氢酶
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树脂固定化复合物添加到体积浓度2～6％的PEI水溶液中，在28℃、200rpm下孵育过夜，并用0.2M、pH7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，对氨基树脂表面进行PEI修饰，实现了树脂表面局部带正电的微环境，获得PEI修饰树脂；
[0023](4)醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶
[0024]将醛酮还原酶纯酶液加入步骤(3)PEI修饰树脂，在28℃、200rpm下孵育18小时，通过PEI和醛酮还原酶酶分子静电吸附作用，有效固定醛酮还原酶，用0.2M、pH7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，获得醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
[0025]本专利技术还提供一种所述醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶在不对称还原6
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氰基
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(5R)
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羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯制备6
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氰基
‑
(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述应用的方法按如下步骤进行：以醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶为催化剂，以6
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氰基
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(5R)
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羟基
‑3‑
羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，添加NADPH，pH 4
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10(优选pH为6)的缓冲液为反应介质，在25
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65℃(优选40℃)下反应4h后，反应结束，反应液分离纯化，获得6
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氰基
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(3R,5R)
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二羟基己酸叔丁酯。
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述共固定化酶以氨基树脂为载体，以戊二醛为交联剂，以聚乙烯亚胺为修饰聚合物，以醛酮还原酶纯酶液和葡萄糖脱氢酶纯酶液为活性组分，于0.2M，pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液中，在28℃、200rpm条件下搅拌孵育18h，离心，收集沉淀，获得醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶。2.如权利要求1所述醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述氨基树脂包括氨基树脂LXTE
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700，氨基树脂LXTE
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703，氨基树脂LXTE
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704，氨基树脂LXTE
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705。3.如权利要求1所述醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述戊二醛以体积浓度0.5
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2％戊二醛的0.2M，pH 7.0磷酸钠缓冲液的形式加入，所述戊二醛的磷酸钠缓冲液体积加入量以载体质量计为5
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15mL/g；所述聚乙烯亚胺以体积浓度2
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6％聚乙烯亚胺水溶液的形式加入，所述聚乙烯亚胺水溶液体积加入量以载体质量计为10
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30mL/g；所述醛酮还原酶纯酶液以蛋白含量计与载体质量比为0.0025
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0.05:1；所述葡萄糖脱氢酶纯酶液以蛋白含量计与载体质量比为0.001
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0.02:1。4.如权利要求1所述醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述醛酮还原酶纯酶液和葡萄糖脱氢酶纯酶液按如下方法制备：(1)工程菌：将源自马克斯克鲁维酵母的醛酮还原酶KmAKR基因人工合成后，连接至pET28a载体的多克隆位点，再将重组载体pET28a转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得表达醛酮还原酶KmAKR重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
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kmAKR；所述醛酮还原酶KmAKR基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)粗酶液：将步骤(1)重组大肠杆菌接种至LB固体培养基，37℃培养12h，获得活化菌体；将活化菌体接种至LB液体培养基，37℃、200rpm培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm培养2h至OD值0.6
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0.8，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃，200rpm培养12h后，4℃、8000rpm下离心10min，获得相应的湿菌体细胞；按照每1g湿菌体悬浮于20mL的pH 7、20mM磷酸钠缓冲液中制备菌悬液，在功率300W、破碎1s、暂停3s的条件下超声破碎30min，12000rpm、4℃离心10min，收集上清，0.45μm微膜过滤，滤液即为醛酮还原酶粗酶液；(3)纯酶液：镍柱用A液平衡后，上样步骤(2)粗酶液，上样量1
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2个柱体积，然后用A液冲洗3
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4个柱体积，去除杂质和结合较弱的蛋白；再用B液洗脱目的蛋白并收集后置于冰上保存，再用50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析12h，收集截留液，即为醛酮还原酶纯酶液；所述A液为含300mM NaCl和20mM咪唑的pH 7.0，20mM磷酸钠缓冲液；所述B液为含300mM NaCl，500mM咪唑的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液；所述葡萄糖脱氢酶纯酶液制备步骤和醛酮还原酶纯酶液的步骤相同，葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.如权利要求1所述醛酮还原酶
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葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述共固定化酶按以下方法制备获得：(1)戊二醛修饰氨基树脂将氨基树脂加入含体积浓度0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：王亚军，张文，李树芳，邵紫晴，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：