用于生产L-缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了用于生产L

【技术实现步骤摘要】
用于生产L
‑
缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
中，用于生产L
‑
缬氨酸的大肠杆菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]在微生物中，L
‑
缬氨酸(支链氨基酸的一种)是从丙酮酸开始，经由乙酰乳酸、二羟基异戊酸和酮异戊酸生物合成的。通过乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、二羟酸脱水酶和转氨酶B催化的反应产生这些中间代谢产物。然而，这些酶还参与从丁酮酸和丙酮酸开始的L
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异亮氨酸的生物合成，而且L
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亮氨酸也从酮异戊酸(一种中间代谢产物)开始，经由2
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异丙基苹果酸、3
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异丙基苹果酸和酮异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸(即L
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缬氨酸、L
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异亮氨酸和L
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亮氨酸)使用相同的酶用于其生物合成过程，所以已知工业上通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产受到由L
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缬氨酸(其为终产物)或其衍生物引起的反馈抑制的限制。
[0003]大肠杆菌具有明确的遗传背景，是氨基酸生产中具有吸引力的工业化生产底盘。然而，相比于谷氨酸棒杆菌，生产L
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缬氨酸的大肠杆菌菌株的相关报道较少，这可能是由于大肠杆菌对L
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缬氨酸生物合成的调节机制更为复杂。乙酰羟基酸合酶(AHAS)是L
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缬氨酸生物合成的限速酶，大肠杆菌有三种AHAS同工酶，由ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，具有不同的性质和调节机制。Park等人报道了通过Escherichia coli W3110和Escherichia coli W的系统代谢工程改造L
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缬氨酸生产菌株，其L
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缬氨酸终产量达到60.7g/L，糖酸转化率为0.22g/g。除了诱变育种和常规代谢工程修饰外，辅因子平衡也被认为是提高L
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缬氨酸产量的关键瓶颈。由于胞内辅因子影响代谢网络、信号转导和物质运输，进而影响微生物细胞的生理功能。在微生物发酵生产化学品的过程中，化学品的效价和产量往往受到辅因子不平衡的限制，这主要是由合成途径中辅因子依赖酶的不平衡表达引起的。Savrasova和Stoynova等人通过用异源NADH依赖性亮氨酸脱氢酶替换天然NADPH依赖性转氨酶，构建了一株以大肠杆菌MG1655为出发菌株的L
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缬氨酸工程菌。在微需氧条件下，该菌株的糖酸转化率(0.23g/g)仅为最大理论产量0.65g/g的35.4％。开发生物传感器高通量筛选方法，引入外源辅酶再生途径以平衡胞内辅因子，构建高效的工业底盘生产菌株，是需要解决关键科学问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何提高L
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缬氨酸产量。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于生产L
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缬氨酸的工程菌，所述工程菌为对受体菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A4）；A4）包括A41）、A42）和A43）：A41）敲除所述受体菌的lacI基因，抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；A42）敲除所述受体菌的lacZ基因，抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基因编码的蛋白质的活性；
A43）增加所述受体菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性。
[0006]其中，所述受体菌含有lacI基因（GeneID:945007，更新日期2023
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04
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14）、lacZ基因（GeneID:945006，更新日期2023
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04
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14）。
[0007]上述工程菌中，所述DNA聚合酶可来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0008]上述工程菌中，所述DNA聚合酶可为序列表中SEQ ID No.10所示的蛋白质。
[0009]上述工程菌中，所述DNA聚合酶的编码基因可为序列表中SEQ ID No.9的第701
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3352位所示的DNA分子。
[0010]所述DNA聚合酶编码基因的表达由能在所述工程菌中启动所述基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。
[0011]在本专利技术的另一个实施例中，所述DNA聚合酶编码基因的表达由PxylF启动子启动，所述PxylF启动子为SEQ ID No.9的第3353
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3617位所示的DNA分子。
[0012]具体的，A4）可通过CRISPR/Cas9系统，利用靶向lacI和lacZ基因的sgRNA与作为供体的SEQ ID No.9所示的DNA片段进行基因编辑实现。
[0013]上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0014]上述工程菌中，所述改造可还包括A5）：A5）包括A51）和A52）：A51）敲除所述受体菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；A52）增加所述受体菌中ilvC基因编码蛋白质的含量或增强所述ilvC基因编码蛋白质的活性。
[0015]所述受体菌还含有ycgH基因（GeneID:2847703，更新日期2023
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04
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14）。
[0016]上述工程菌中，所述ilvC基因来可源于大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0017]上述工程菌中，所述ilvC基因可编码序列表中SEQ ID No.12所示的蛋白质。
[0018]上述工程菌中，所述ilvC基因可为序列表中SEQ ID No.11的第794
‑
2269位所示的DNA分子。
[0019]所述ilvC基因的表达由能在所述工程菌中启动相应基因表达的启动子启动，包括但不限于强启动子，组成型启动子。
[0020]在本专利技术的另一个实施例中，所述ilvC基因的表达由Ptrc启动子启动，所述Ptrc启动子为SEQ ID No.11的第2270
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2343位所示的DNA分子。
[0021]具体的，A5）可通过CRISPR/Cas9系统，利用靶向ycgH基因的sgRNA与作为供体的SEQ ID No.11所示的DNA片段进行基因编辑实现。
[0022]上述工程菌中，所述受体菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）。
[0023]本专利技术的受体菌包括但不限于大肠埃希氏菌（Escherichia coli），任何含有lacI和lacZ基因、ycgH基因且可以合成L
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缬氨酸的细菌均可利用本专利技术的方法来制备重组菌并生产L
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赖氨酸，所述细菌可为大肠埃希氏菌（Escherichia 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产L
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缬氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为对受体大肠杆菌进行改造得到的重组菌；所述改造包括A4）；A4）包括A41）、A42）和A43）：A41）敲除所述受体大肠杆菌的lacI基因，抑制所述lacI基因的表达或抑制所述lacI基因编码的蛋白质的活性；A42）敲除所述受体大肠杆菌的lacZ基因，抑制所述lacZ基因的表达或抑制所述lacZ基因编码的蛋白质的活性；A43）增加所述受体大肠杆菌中DNA聚合酶的含量或增强所述DNA聚合酶的活性。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于：所述DNA聚合酶来源于大肠杆菌（Escherichia coli）。3.根据权利要求2所述的大肠杆菌，其特征在于：所述DNA聚合酶为序列表中SEQ ID No.10所示的蛋白质。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于：所述DNA聚合酶的编码基因为序列表中SEQ ID No.9的第701
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3352位所示的DNA分子。5.根据权利要求1
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4中任一所述的大肠杆菌，其特征在于：所述改造还包括A5）：A5）包括A51）和A52）：A51）敲除所述受体大肠杆菌的ycgH基因，抑制所述ycgH基因的表达或抑制所述ycgH基因编码的蛋白质的活性；A52）增加所述受体大肠杆菌中ilvC基因编码蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏爱英，孟刚，毕国东，赵春光，周晓群，王吉玮，张晓琴，王攀，
申请(专利权)人：黑龙江伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：