一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术是利用杆状病毒表达系统表达制备BCoV重组S1蛋白，并以纯化后的BCoV

【技术实现步骤摘要】
一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，临床上能引起犊牛出血性腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染。该病毒在世界范围内广泛存在，除感染牛以外，也可以感染野生反刍动物。1972年美国的Mebus等曾在犊牛和成年牛的腹泻病料中首次检出BCoV病原。1985年宋广林首次报道了BCoV在我国的存在情况，随后BCoV在我国各个省份多次被成功检测出，阳性率高达70％，表明BCoV的感染率很高。1988年，研究人员从德国一名儿童腹泻样品中分离出一株与BCoV基因组关系密切的毒株，提示BCoV可能存在跨物种传播的可能。然而，目前尚无针对牛冠状病毒病的特效治疗药物，且国外研制的疫苗保护效果不佳，广谱性差。
[0003]基于以上，快速、特异、灵敏的BCoV检测对于疾病监测和控制非常重要。目前国内用于检测BCoV主要是通过RT
‑
PCR或荧光定量检测，操作繁琐并且对于检测人员要求较高；建立的检测BCoV抗体的方法大多是原核表达N蛋白建立的ELISA检测方法，其抗原性大大减低。因此，建立特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的病毒抗体检测方法有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过以杆状病毒表达系统表达S1全长作为包被抗原，建立的特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的病毒抗体检测方法，适合用于牛冠状病毒抗体的现场检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于酶标板上的BCoV
‑
S1蛋白重组抗原。
[0007]优选的是，所述BCoV
‑
S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：MKFLVNVALVFMVVYISYIYAFLILLISLPTAFAVIGDLKCTTVSINDVDTGVPSISTDTVDVTNGLGTYYVLDRVYLNTTLLLNGYYPTSGSTYRNMALKGTLLLSTLWFKPPFLSDFTNGIFAKVKNTKVIKDGVMYSEFPAITIGSTFVNTSYSVVVQPHTTNLDNKLQGFLEISVCQYTMCEYPNTICHPNLGNQRVELWHWDTGVVSCLYKRNFTYDVNADYLYFHFYQEGGTFYAYFTDTGVVTKFLFNVYLGTVLSHYYVMPLTCNSALTLEYWVTPLTSKQYLLAFNQDGVIFNAVDCKSDFMSEIKCKTLSIAPSTGVYELNGYTVQPIADVYRRIPNLPDCNIEAWLNDKSVPSPLNWERKTFSNCNFNMSSLMSFIQADSFTCNNIDAAKIYGMCFSSITIDKFAIPNGRKVDLQLGNLGYLQSFNYRIDTTATSCQLYYNLPAANVSVSRFNPSTWNRRFGFTEQSVFKPQPAGVFTDHDVVYAQHCFKAPTNFCPCKLDGSLCVGSGSGIDAGYKHTGIGTCPAGTNYLTCHNAAQCDCLCTPDPITSKATGPYKCPQTKYLVGIGEHCSGLAIKSDHCGGNPCSCQPQAFLGWSVDSCLQGDRCNIFANFILHDVNSGTTCSTDLQKSNTDIILGVCVNYDLYGITGQGIFVEVNATYYNSWQNLLYDSNGNLYGFRDYLTNRT
FMIRSCYSGRVSAAFHANSSEPALLFRNIKCNYVFNNTLLRQLQPINYFDSYLGCVVNADNSTSSVVQTCDLTVGSGYCVDYSTKRRSRRHHHHHHHH*.
[0008]优选的是，所述试剂盒还包括：封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、显色液。
[0009]优选的是，所述BCoV
‑
S1蛋白重组抗原的制备方法包括：将牛冠状病毒的S1基因序列经过密码子优化后，在3
’
端加入组氨酸标签，在S1基因序列两端引入BamHI和HindIII限制性酶切位点后，再转入载体中，构建重组质粒；将所述的重组质粒转染Sf9昆虫细胞，经培养，获取病毒上清液，再经分离纯化，即得BCoV
‑
S1蛋白重组抗原。
[0010]优选的是，所述BCoV
‑
S1蛋白重组抗原的最佳包被量为0.125μg/mL；最佳封闭条件为：37℃封闭3h；所述酶标二抗为兔抗牛IgG
‑
HRP抗体，最佳稀释度为1:25000，孵育时间为37℃45min；最佳显色条件为37℃13min。
[0011]本专利技术还提供所述的检测试剂盒在非诊断目的的鉴定牛冠状病毒中的应用，利用所述的检测试剂盒，采用间接ELISA检测方法检测待测样品，以判断所述待测样品中是否含有牛冠状病毒。
[0012]优选的是，所述采用间接ELISA检测待测样品具体包括以下步骤：
[0013](1)待检血清孵育：将待测样品进行倍比稀释，孵育；之后洗涤；
[0014](2)酶标二抗孵育：稀释兔抗牛IgG
‑
HRP抗体，孵育；之后洗涤；
[0015](3)底物显色：避光加入显色液，孵育完成后，加入终止液终止反应，测定待测样品的OD
450nm
值和P/N值，以判断是否含有牛冠状病毒。
[0016]优选的是，步骤(1)
‑
(2)中，洗涤液均为0.05％吐温20的PBST溶液。
[0017]优选的是，所述判断是否含有牛冠状病毒的标准为：阴阳性临界值OD
450nm
≥0.297为阳性，即为反之，OD
450nm
﹤0.297判定为阴性。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]血清学诊断的关键是靶标抗原必要的构象折叠与修饰，牛冠状病毒(BCoV)S蛋白其中的S1亚基上有主要的中和表位，能够诱导中和抗体的产生，为牛冠状病毒检测和诊断提供依据，具体的，本专利技术BCoV
‑
S1是由杆状病毒表达系统表达获取，与现有检测方法的BCoV
‑
N蛋白原核表达相比其抗原性大大提高。
[0020]本专利技术所建立的间接ELISA抗体检测方法，其灵敏度高达1:3200；与牛病毒性腹泻、牛轮状病毒、牛星状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒阳性血清无交叉反应；重复性实验显示，所检测的样品在不同批次内的变异系数在1.20％
‑
7.12％之间，均小于10％，而在同一批次不同时间段内的变异系数在0.05％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于酶标板上的BCoV
‑
S1蛋白重组抗原。2.根据权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV
‑
S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：封闭液、洗涤液、阳性对照、阴性对照、酶标二抗、显色液。4.如权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV
‑
S1蛋白重组抗原的制备方法包括：将牛冠状病毒的S1基因序列经过密码子优化后，在3
’
端加入组氨酸标签，在S1基因序列两端引入BamHI和HindIII限制性酶切位点后，再转入载体中，构建重组质粒；将所述的重组质粒转染Sf9昆虫细胞，经培养，获取病毒上清液，再经分离纯化，即得BCoV
‑
S1蛋白重组抗原。5.如权利要求1所述的牛冠状病毒间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述BCoV
‑
S1蛋白重组抗原的最佳包被量为0.125μg/mL；最佳封闭条件为：37℃封闭3h；所述酶标二抗为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李基棕，李彬，黄金，李思远，毛立，蔡旭航，孙敏，范宝超，周金柱，周俊明，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：