用于发酵生产L-缬氨酸的重组大肠杆菌制造技术

本发明专利技术公开了用于发酵生产L

【技术实现步骤摘要】
用于发酵生产L
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缬氨酸的重组大肠杆菌


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及用于发酵生产L
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缬氨酸的重组大肠杆菌。

技术介绍

[0002]L
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缬氨酸在食品、医药、保健品﹑饲料等领域均有着重要的应用。目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L
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缬氨酸的生产，很多实验室也在开展关于L
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缬氨酸发酵工艺研究的课题。研究人员发现，胞内L
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缬氨酸透过细胞膜分泌到胞外的过程需要特定转运蛋白的参与，但在该过程中，特定转运蛋白活性不能满足及时将胞内缬氨酸透过细胞膜分泌到胞外，导致胞内L
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缬氨酸积累；同时，在菌体细胞内含有乙酰羟酸合酶，乙酰羟酸合酶对L
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颉氨酸的生物合成有催化作用，可以促进产酸，但是当菌体细胞内合成的L
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缬氨酸不能及时外排产生积累时，乙酰羟酸合酶受到L
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缬氨酸的强烈抑制，其催化作用下降，不能进一步催化合成L
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缬氨酸，L
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缬氨酸的继续合成就受到限制，最终导致产量低。另外，研究发现大肠杆菌对L
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缬氨酸非常敏感，当L
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缬氨酸生产菌胞内的L
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缬氨酸不能及时排出产生积累时，会严重抑制大肠杆菌的生长，进而导致菌胞内L
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缬氨酸的合成受到抑制，导致产量低。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的为如何提高L
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氨基酸的产量，本专利技术的目的不限于所描述的主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它目的。
[0004]本专利技术首先保护一种工程菌，可为体内抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性的微生物；所述微生物可以生产缬氨酸。
[0005]所述乙醇脱氢酶为B1）、B2）或B3）：B1）氨基酸序列如SEQ ID No：11所示的蛋白质；B2）将B1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；B3）在B1）或B2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0006]上述工程菌中，所述抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中乙醇脱氢酶的编码基因（即adhE基因）来实现的。
[0007]所述抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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adhE sgRNA质粒和SEQ ID No：3所示的ΔadhE
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Up
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Down片段实现。
[0008]上述工程菌的体内还抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶。
[0009]所述微生物来源的分支链氨基酸转氨酶为C1）、C2）或C3）：C1）氨基酸序列如SEQ ID No：12所示的蛋白质；C2）将C1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3）在C1）或C2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0010]所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶为D1）、D2）或D3）：D1）氨基酸序列如SEQ ID No：13所示的蛋白质；D2）将D1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；D3）在D1）或D2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0011]上述工程菌中，所述抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（E）基因）来实现的。
[0012]上述工程菌中，所述含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶是通过向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因（即ilvE（B）基因）来实现的。
[0013]上述工程菌中，所述向微生物中敲入或导入枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因是通过向微生物中导入表达盒来实现的；所述表达盒包括启动子和枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的编码基因。所述启动子可为诱导型启动子。所述诱导型启动子具体可为ptrc启动子。
[0014]所述抑制或下调微生物来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性和含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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ilvE sgRNA质粒和SEQ ID No：6所示的ptrc
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ilvE(B)
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Up
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Down片段实现。
[0015]上述工程菌的体内还抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性。
[0016]所述硫胺磷酸合酶为E1）、E2）或E3）：E1）氨基酸序列如SEQ ID No：14所示的蛋白质；E2）将E1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；E3）在E1）或E2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0017]上述工程菌中，所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中硫胺磷酸合酶的编码基因（即thiE基因）来实现的。
[0018]所述抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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thiE sgRNA质粒和SEQ ID No：8所示的ΔthiE
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Up
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Down片段实现。
[0019]上述工程菌的体内还抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性。
[0020]所述苹果酸脱氢酶为F1）、F2）或F3）：F1）氨基酸序列如SEQ ID No：15所示的蛋白质；F2）将F1）所示蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；F3）在F1）或F2）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
[0021]上述工程菌中，所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性是通过敲除或敲低微生物中苹果酸脱氢酶的编码基因（即mdh基因）来实现的。
[0022]所述抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性可通过向微生物中导入实施例提及的pGRB
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mdh sgRNA质粒和SEQ ID No：10所示的Δmdh
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Up
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Down片段实现。
[0023]本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程菌，为体内抑制或下调乙醇脱氢酶的表达量和/或活性的大肠杆菌；所述大肠杆菌可以生产缬氨酸；所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的体内还抑制或下调大肠杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且含有或表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶；所述大肠杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示；所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示。3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的体内还抑制或下调硫胺磷酸合酶的表达量和/或活性；所述硫胺磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示。4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌的体内还抑制或下调苹果酸脱氢酶的表达量和/或活性；所述苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。5.制备生产缬氨酸的工程菌的方法，其特征在于：所述方法包括步骤（a1）：降低大肠杆菌中乙醇脱氢酶的表达量和/或活性；所述大肠杆菌可以生产缬氨酸；所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（a2）：完成步骤（a1）后，降低所述大肠杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的表达量和/或活性且在所述大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶；所述大肠杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示；所述枯草芽孢杆菌来源的分支链氨基酸转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤（a3）：完成步骤（a2）后，降低...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏厚波，孟刚，魏爱英，赵春光，毕国东，张英，张晓琴，
申请(专利权)人：北京中科伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：