一种依克多因的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种依克多因的生产方法，包括种子液培养、发酵及纯化工序，本发明专利技术提供的依克多因生产工艺可高效生产出符合工业化的高纯度依克多因，此工艺发酵时间短，所得产品产量较高，纯度好，质量可靠。整体工艺操作简单，方便快捷，设备损耗小，大大降低了生产成本。本。本。

【技术实现步骤摘要】
一种依克多因的生产方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种依克多因的生产方法。

技术介绍

[0002]依克多因(Ectoine)又称“耐盐菌萃取液”，化学名为四氢嘧啶，分子式为C6H
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N2O2，是一种氨基酸衍生物，最早来源于高嗜盐菌，能够保护高嗜盐菌在高盐、高温、高紫外线辐射的极端情况下免受伤害。
[0003]依克多因作为一种小分子亲水性物质，能够结合周围环境中的水分子在细胞及蛋白质的周围形成一层“水合壳”，类似一层保护膜，减少皮肤水分流失，具有很好的保湿效果。其次，它也能够提升皮肤细胞的免疫防护能力，增加细胞修正能力，具有较好的抗过敏、消炎效果。在对抗紫外线方面，具有修正紫外线导致的细胞DNA损伤，防止细胞膜结构受到伤害。因此，它被广泛的运用于护肤品及治疗特应性皮炎、阿尔茨海默症、放化疗、肝硬化等病症中，极具市场潜力。
[0004]随着市场需求的不断加大，对于依克多因的产量要求也相应增加。目前，依克多因主要是以嗜盐菌发酵来获得，如李珍爱等人(一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产依克多因的生产方法，申请号:201911272352.1)利用高盐(5％
‑
10％)培养基发酵培养72h后，依克多因产量达到14g/L。然而这些方法需要高盐浓度，这也使依克多因的生产工艺变的复杂化，而设备的腐蚀也会缩短使用寿命从而增加生产成本。所以越来越多的人们将目光转向于改造模式大肠杆菌及酵母菌，用于发酵生产依克多因，如王金刚等人(用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体，申请号:202111401151.4)利用大肠杆菌w3110进行改造，诱导发酵48h后，产量达到2.14g/L；而多米尼克
·
路易斯等人(产依克多因酵母，申请号:201880046773.X)利用酵母菌进行改造，发酵24h后，产量达到6.4g/L。总体而言，改造后的菌株产量较低，不利于工业化生产，相对成本较高。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效的依克多因的生产方法。
[0006]本专利技术的技术方案为：一种依克多因的生产方法，包括以下步骤：
[0007](1)种子液培养：将大肠杆菌BL21代谢工程菌进行活化、一级种子液培养、二级种子液培养；
[0008](2)发酵：将步骤(1)处理后得到的二级种子液按10％接种量接种至发酵培养基中，在温度35.5
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36.5℃，罐压0.04
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0.06Mpa，通风量75
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225m3/h，转速200
‑
300rpm，溶氧30％
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50％，pH维持7的条件下进行发酵，当培养基中葡萄糖浓度降至趋于0g/L，溶氧和pH快速回升时，立刻流加葡萄糖使溶氧降至30％以下，维持流加葡萄糖至发酵后34h，然后关闭流加葡萄糖，继续发酵；发酵至42
‑
46h，测定依克多因产量达到50g/L后，停止发酵；所述发酵培养基组成为：酵母浸粉16g/L，木糖6g/L，一水柠檬酸2.2g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，七水硫酸镁2.1g/L，硫酸亚铁22mg/L，一水硫酸锰11mg/L，维生素B1 2mg/L，维生素B3 2mg/L，维
生素B5 2mg/L，维生素B12 0.5mg/L，维生素H1mg/L，蛋氨酸0.2g/L，消泡剂0.3g/L，葡萄糖30g/L；
[0009](3)纯化：将步骤(2)处理后的发酵液降温至35℃，用4％的硫酸调节pH为3～3.5，当开始产生絮状物时立刻停止搅拌，静置2～4小时后依次进行离心、脱色、板框过滤、陶瓷膜过滤、阳离子树脂吸附、浓缩、阴离子树脂吸附、第二次浓缩、第二次脱色、第二次板框过滤、第三次浓缩，最后结晶、干燥得到成品。
[0010]进一步地，步骤(1)中活化的方法为：将菌种划线至平板培养基上，37℃恒温培养12～14h，所述平板培养基组成为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L；灭菌前pH为7.2
‑7‑
4。
[0011]进一步地，步骤(1)中一级种子液的培养方法为：将活化后的菌种接种至一级种子液培养基中，在摇床上37℃、200rpm培养5～7h；所述一级种子液培养基组成为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，灭菌前pH为7.2
‑7‑
4。
[0012]进一步地，步骤(1)中二级种子液的培养方法为：将一级种子液接种至二级种子液培养基中，在温度35.5
‑
36.5℃，罐压0.04
‑
0.06Mpa，转速200～500rpm，通风量3～9m3/h，溶氧保持20％以上的条件下进行培养7～9h，培养过程中通过氨水维持pH在7.0～7.1；所述二级种子液培养基组成为：酵母浸粉18g/L，蛋白胨4g/L，一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾1.25g/L，七水硫酸镁0.6g/L，维生素B1 1.5mg/L，维生素B3 1.5mg/L，维生素B5 1.5mg/L，维生素B12 0.5mg/L，消泡剂0.3g/L，葡萄糖30g/L。
[0013]进一步地，步骤(3)中所述离心的方法为：首先将静置后的发酵液进行离心，使菌渣与清液分离，清洗菌渣并将清洗液与清液合并，将合并后的清液保持在34～40℃，加入2g/L的聚季铵盐，搅匀后立即停止搅拌，静置4～6小时候进行重复离心。
[0014]进一步地，步骤(3)中所述脱色的方法为：向经过离心处理的清液中加入活性炭，加热至55℃，保持1
‑
2h。
[0015]进一步地，步骤(3)中所述陶瓷膜过滤的参数为：进料压力为0.5Mpa，内压0.3
‑
0.4Mpa，频率为15
‑
16.5HZ，料液温度不超过60℃。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0017]本专利技术提供的依克多因生产工艺可高效生产出符合工业化的高纯度依克多因，此工艺发酵时间短，所得产品产量较高，纯度好，质量可靠。整体工艺操作简单，方便快捷，设备损耗小，大大降低了生产成本。
附图说明
[0018]图1菌株在5T发酵罐的生长曲线图；
[0019]图2菌株在5T发酵培养依克多因的产量随时间的变化图。
具体实施方式
[0020]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0021]实施例1：
[0022]种子的活化及种瓶培养
[0023]从种子保存超低温冰箱中拿出依克多因菌株大肠杆菌BL21代谢工程菌，在超净工作台上接种一环菌液划线至平板培养基中，倒置放在37℃恒温培养箱中，培养12
‑
14h，观察无杂菌后，送质检检测，无杂菌则合格。平板培养基组成为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种依克多因的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)种子液培养：将大肠杆菌BL21代谢工程菌进行活化、一级种子液培养、二级种子液培养；(2)发酵：将步骤(1)处理后得到的二级种子液按10％接种量接种至发酵培养基中，在温度35.5
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36.5℃，罐压0.04
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0.06Mpa，通风量75
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225m3/h，转速200
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300rpm，溶氧30％
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50％，pH维持7的条件下进行发酵，当培养基中葡萄糖浓度降至趋于0g/L，溶氧和pH快速回升时，立刻流加葡萄糖使溶氧降至30％以下，维持流加葡萄糖至发酵后34h，然后关闭流加葡萄糖，继续发酵；发酵至42
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46h，测定依克多因产量达到50g/L后，停止发酵；所述发酵培养基组成为：酵母浸粉16g/L，木糖6g/L，一水柠檬酸2.2g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，七水硫酸镁2.1g/L，硫酸亚铁22mg/L，一水硫酸锰11mg/L，维生素B1 2mg/L，维生素B3 2mg/L，维生素B5 2mg/L，维生素B12 0.5mg/L，维生素H1mg/L，蛋氨酸0.2g/L，消泡剂0.3g/L，葡萄糖30g/L；(3)纯化：将步骤(2)处理后的发酵液降温至35℃，用4％的硫酸调节pH为3～3.5，当开始产生絮状物时立刻停止搅拌，静置2～4小时后依次进行离心、脱色、板框过滤、陶瓷膜过滤、阳离子树脂吸附、浓缩、阴离子树脂吸附、第二次浓缩、第二次脱色、第二次板框过滤、第三次浓缩，最后结晶、干燥得到成品。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中活化的方法为：将菌种划线至平板培养基上，37℃恒温培养12～14h，所述平板培养基组成为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L；灭菌前pH为7.2
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【专利技术属性】
技术研发人员：吴生亮，曾帅，
申请(专利权)人：绵阳晟氏健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：