一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法。采用含有玉屏风散的培养基对受到氧化损伤的人心肌细胞AC16进行培养。通过含有玉屏风散的培养基在体外对受到氧化损伤的人心肌细胞AC16进行培养，发现培养后的人心肌细胞AC16中，氧化损伤标志物中，Nrf2和HO

【技术实现步骤摘要】
一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法。

技术介绍

[0002]玉屏风散出自元
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朱丹溪的《丹溪心法》，由黄芪、白术、防风组成，为益气、固表、止汗的传统方剂，清
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柯韵伯认为：“夫以防风之善驱风，得黄芪以固表，则外有所卫，得白术以固里，则内有所据，风邪去而不复来，当倚如屏、珍如玉也”，其中黄芪补肺气固表，与白术合用健脾益气，培土生金，防风祛风解表，与黄芪配伍，共御风邪，一补一散，相辅相成，共奏益气固表之功，故曰玉屏风。
[0003]研究表明，氧化是造成心肌细胞损伤的重要因素之一。同时，随着氧化持续的时间增加，心肌细胞的损伤也会逐渐加重。另外，对于已经出现氧化损伤的心肌细胞，即便是与氧化物隔离，其受到的氧化损伤也是持续存在的。因此，需要采用其他的方法对受到氧化损伤的心肌细胞进行修复。
[0004]目前尚未有报道玉屏风散与修复心肌细胞损伤之间的关联。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，采用含有玉屏风散的培养基对受到氧化损伤的人心肌细胞AC16进行培养；所述人心肌细胞AC16为对数生长期的人心肌细胞AC16。
[0008]进一步，包括以下步骤：
[0009]S1、取对数生长期的所述人心肌细胞AC16，采用含有FBS的DMEM/F12培养基将所述人心肌细胞AC16的细胞密度调整至5
×
104/ml
‑2×
105/ml；其中，所述FBS的质量百分数占总培养基质量的10％；
[0010]S2、对所述人心肌细胞AC16进行过夜培养；
[0011]S3、将所述玉屏风散与DMEM/F12培养基混合，得到所述含有玉屏风散的培养基，采用所述含有玉屏风散的培养基对步骤S2培养后的所述人心肌细胞AC16进行预孵育，预孵育后，再加入H2O2进行共同孵育，共同孵育后，加入CCK8溶液，继续孵育。
[0012]进一步，所述步骤S3中，所述混合培养基中的玉屏风散的浓度为50
‑
1000ug/mL。
[0013]进一步，所述步骤S3中，H2O2的添加量为250uM/L。
[0014]进一步，所述含有玉屏风散的培养基的制备方法为，先制备玉屏风散冻干粉，再采用生理盐水将将所述玉屏风散冻干粉配制成玉屏风散溶液，最后将所述玉屏风散溶液与DMEM/F12培养基混合；
[0015]所述玉屏风散冻干粉的制备方法为，按照质量比为3：1：1的比例分别称取生黄芪、
白术、防风，加水煎煮、过滤，将得到的滤液浓缩并水浴得到玉屏风散溶液；将所述玉屏风散溶液冷却至
‑
20℃后，在
‑
80℃的温度下储存过夜，再在冻干机中干燥24h，研磨后，在冻干机中进行二次干燥24h，得到所述玉屏风散冻干粉。
[0016]进一步，还包括检测培养后所述人心肌细胞AC16的细胞活力和/或细胞凋亡数的步骤。
[0017]进一步，还包括检测培养后所述人心肌细胞AC16的细胞活性氧含量的步骤。
[0018]进一步，还包括检测培养后所述人心肌细胞AC16的细胞上清液中过氧化氢酶的活力、超氧化物歧化酶的活力以及丙二醛含量的步骤。
[0019]进一步，还包括检测培养后所述人心肌细胞AC16中，抗氧化信号通路中，Nrf2、Keap1、HO
‑
1的mRNA表达量和/或蛋白表达量的步骤。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021](1)本专利技术的在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，通过含有玉屏风散的培养基在体外对受到氧化损伤的人心肌细胞AC16进行培养，发现培养后的人心肌细胞AC16中，Nrf2和HO
‑
1的mRNA表达明显升高，Keap1的mRNA表达显著下降；HO
‑
1和NEs
‑
Nrf2的蛋白表达明显升高，Keap1的蛋白表达明显降低，Nrf2的蛋白表达未见明显变化；这说明玉屏风散对人心肌细胞AC16的氧化损伤具有明显保护和修复作用，其机制是通过调控Keap1/Nrf2/HO
‑
1通路，抑制Keap1表达、促进Nrf2核转位、影响下游HO
‑
1等蛋白表达；
[0022](2)本专利技术的在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，采用H2O2制备人心肌细胞氧化损伤模型；过氧化氢的氧化能力很强，能够使人心肌细胞受到更加显著和严重的氧化损伤；玉屏风散能够有效修复过氧化氢造成的人心肌细胞氧化损伤，进一步说明了其修复和保护的效果显著；
[0023](3)本专利技术的在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，还检测了培养后人心肌细胞AC16的细胞活力、细胞凋亡数、细胞活性氧含量、细胞上清液中过氧化氢酶的活力、超氧化物歧化酶的活力以及丙二醛含量，进一步证明了玉屏风散能够全方位的对氧化损伤的心肌细胞进行修复和保护；
[0024](4)本专利技术的在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，开发了玉屏风散的新用途，为实验室中修复心肌细胞氧化损伤、建立相关试验模型等研究提供了新的思路和启示。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的实施例1中，各实验组的玉屏风散对人心肌细胞AC16活力的影响对比图；
[0026]图2为本专利技术的实施例2中，不同H2O2浓度对AC16细胞活力的影响对比图；
[0027]图3为本专利技术的实施例3中，各实验组的玉屏风散对H2O2氧化损伤AC16细胞活力的影响对比图；
[0028]图4为本专利技术的实施例4中，各实验组的玉屏风散对H2O2氧化损伤AC16细胞凋亡情况的影响对比图，其中，图4中A为各实验组的荧光检测图，图4中B为细胞凋亡率；
[0029]图5为专利技术的实施例5中，各实验组的玉屏风散对H2O2氧化损伤AC16细胞中ROS含量的影响对比图，其中，图5中A为各实验组的荧光检测图，图5中B为细胞中ROS相对荧光强度；
[0030]图6为专利技术的实施例6中，各实验组的玉屏风散对H2O2氧化损伤AC16细胞上清液中
CAT、SOD活力及MDA含量的影响；图6中A为各实验组的CAT含量对比图，图6中B为各实验组的SOD含量对比图，图6中C为各实验组的MDA的含量对比图；
[0031]图7中A为各实验组的玉屏风散中Nrf2的mRNA表达的对比图，图7中B为各实验组的玉屏风散中Keap1的mRNA表达的对比图，图7中C为各实验组的玉屏风散中HO
‑
1的mRNA表达的对比图；
[0032]图8中A各实验组玉屏风散对H2O2氧化损伤AC16细胞中Nrf2、Keap1、HO
‑
1以及GAPDH内参的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，其特征在于，采用含有玉屏风散的培养基对受到氧化损伤的人心肌细胞AC16进行培养；所述人心肌细胞AC16为对数生长期的人心肌细胞AC16；所述方法包括以下步骤：S1、取对数生长期的所述人心肌细胞AC16，采用含有FBS的DMEM/F12培养基将所述人心肌细胞AC16的细胞密度调整至5
×
104/ml
ˉ2×
105/ml；S2、对所述人心肌细胞AC16进行过夜培养；S3、将所述玉屏风散与DMEM/F12培养基混合，得到所述含有玉屏风散的培养基，采用所述含有玉屏风散的培养基对步骤S2培养后的所述人心肌细胞AC16进行预孵育，预孵育后，再加入H2O2进行共同孵育，共同孵育后，加入CCK8溶液，继续孵育；所述混合培养基中的玉屏风散的浓度为100ug/mL；H2O2的添加量为250uM/L，CCK8的添加量为10ul。2.根据权利要求1所述一种在体外修复人心肌细胞氧化损伤的方法，其特征在于，所述含有玉屏风散的培养基的制备方法为，先制备玉屏风散冻干粉，再采用生理盐水将将所述玉屏风散冻干粉配制成玉屏风散溶液，最后将所述玉屏风散溶液与DMEM/F12培养基混合；所述玉屏风散...

【专利技术属性】
技术研发人员：来丽丽，池喜峰，王宇，赵成成，郑志伟，
申请(专利权)人：北京基谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：