一种同时检测四种流感病毒亚型的试剂盒及其引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种单管可检测四种流感病毒亚型的检测技术，旨在提供提供了一种对四种流感病毒亚型具有特异性检测作用的引物和探针；在此基础上，提供了一种基于单管多重RT

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测四种流感病毒亚型的试剂盒及其引物和探针


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种单管可检测四种流感病毒亚型的试剂盒，还涉及所述试剂盒中使用的具有特异性的四对引物和四条探针。

技术介绍

[0002]流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，它会造成急性上呼吸道感染，能引起心肌炎、支气管炎等多种并发症。流感病毒可借空气迅速的传播，具有高度传染性，在世界各地常会有周期性的大流行，并呈季节性流行趋势。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）丁（D）四型，其中甲型流感病毒抗原性（HA和NA）易发生变异，多次引起世界性大流行。目前，HA亚型已分为18种 (H1~H18) ，NA亚型已分为11种 (N1~N11)，至今人间流行的主要有H1、H3、N1、N2等亚型。
[0003]目前，针对流感病毒的检测，经典的方法有鸡胚分离培养、血清学方法等。鸡胚分离培养法的缺陷是操作繁琐，耗时很长，不适于快速检测和临床紧急病情处理；血清学方法因技术本身的限制，其灵敏度均比较低，漏检率高。较为现代的方法包括核酸扩增技术（PCR）和实时荧光核酸扩增技术（Real time PCR）等。PCR技术是终点法分析，需要反复升降温的循环扩增和PCR后的凝胶电泳分析结果，耗时较长，容易产生携带污染，使用的染料（EB等）具有致癌性，且其检测灵敏度仍有待提高。实时荧光核酸扩增技术无需电泳分析，操作步骤大大简化，时间成本也降低了不少，并且样品经PCR扩增时可实时观测检测结果，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。
[0004]但是目前针对甲型流感病毒亚型检测建立的方法，均不是单管多重检测，要么一次只能检测单一亚型或者两种亚型，要么仅检测其中部分基因如H1基因代替H1N1亚型，所以都不能很好地对甲型流感病毒亚型进行检测。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种对四种流感病毒亚型具有特异性检测作用的引物和探针；在此基础上，提供了一种基于单管多重RT
‑
PCR技术，利用上述引物和探针实现对四种流感病毒亚型同时、高重复性、高特异性、高灵敏性检测的试剂盒。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：一种检测四种流感病毒亚型用的引物，包括四对引物，每对引物均包括正向引物F和反向引物R，每对引物的正向引物F和反向引物R的碱基序列表示如下：流感病毒H1型：正向引物F1：5
’‑
MGAAAAGAATGTRACAGTAACACACTCTGT
‑3’
，SEQ ID NO：1反向引物R1：5
’‑
GTTTCMACAATGTAGGACCATG
‑3’
，SEQ ID NO：2；流感病毒N1型：
正向引物F2：5
’‑
AGACCTTGYTTCTGGGTTGA
‑3’
，SEQ ID NO：4反向引物R2：5
’‑
ACCGTCTGGCCAAGACCA
‑3’
，SEQ ID NO：5；流感病毒H3型：正向引物F3：5
’‑
ATGGTTGGGAGGGAMTG
‑3’
，SEQ ID NO：7反向引物R3：5
’‑
TGCTGCTTGRGTGCTT
‑3’
，SEQ ID NO：8；流感病毒N2型：正向引物F4：5
’‑
GTCCAACYCTAAGTCCAA
‑3’
，SEQ ID NO：10反向引物R4：5
’‑
RCCACAAAACACAACAATAC
‑3’
，SEQ ID NO：11。
[0007]进一步，所述四对引物的病毒核酸变异位点均使用简并碱基，R为A/G，M为A/C，Y为C/T。
[0008]一种检测四种流感病毒亚型用的探针，包括四条探针P，四条探针P的碱基序列表示如下：流感病毒H1型：探针P1：5
’‑
TexRed
‑
GGTAAATGTAACATTGCTGGCTG
‑
BHQ1
‑3’
，SEQ ID NO：3；流感病毒N1型：探针P2：5
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Cy5
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ATCTGGACTAGYGGGAGCAGCAT
‑
BHQ1
‑3’
，SEQ ID NO：6；流感病毒H3型：探针P3：5
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FAM
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ARGGAAGAGGACAAGCAGCAG
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BHQ1
‑3’
，SEQ ID NO：9；流感病毒N2型：探针P4：5
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HEX
‑
TGTGGAGTTGATTAGGGGAAG
‑
BHQ1
‑3’
，SEQ ID NO：12。
[0009]一种单管可检测四种流感病毒亚型的试剂盒，所述试剂盒包括扩增反应液和酶混合液，所述扩增反应液包含检测四种流感病毒亚型用的引物和检测四种流感病毒亚型用的探针。
[0010]进一步，所述扩增反应液包括如下组分：
。
[0011]进一步，所述酶混合液包括如下组分：。
[0012]进一步，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。
[0013]进一步，所述阳性对照为流感病毒H1、H3、N1、N2亚型体外转录的RNA片段。
[0014]进一步，所述阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水。
[0015]进一步，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。
附图说明
[0016]图1是实施例三中灵敏度分析结果，A
‑
D分别为流感病毒H1、N1、H3、N2亚型样本采用本专利技术所述试剂盒检测时的灵敏度；图2是实施例五中重复性分析结果，A
‑
D分别为流感病毒H1、N1、H3、N2亚型样本采用本专利技术所述试剂盒重复检测8次时的扩增曲线。
具体实施方式
[0017]下面通过具体的流感病毒检测过程来对本专利技术进行说明。
[0018]实施例一：特异性引物设计首先从美国NCBI的基因库下载尽量多的流感病毒H1、N1、H3、N2亚型的基因序列，然后利用分子生物学软件Bioedit对下载的序列进行同源比对分析，寻找高度同源的保守序列作为引物和探针设计的候选区，同时结合软件PrimerSelect进行引物设计。核心设计思想是：综合考虑对不同亚型流感病毒检测的特异性和通用性（在病毒核酸变异位点用简并碱基处理）、引物设计应遵循的普遍性原则（如Tm值、3
’
末端自由能、GC含量、避免出现内部二级结构及形成二聚体等），以及多重扩增反应时各引物之间的相互影响等。对于设计出的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测四种流感病毒亚型用的引物，包括四对引物，每对引物均包括正向引物F和反向引物R，其特征在于：每对引物的正向引物F和反向引物R的碱基序列表示如下：流感病毒H1型：正向引物F1：5
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MGAAAAGAATGTRACAGTAACACACTCTGT
‑3’
，SEQ ID NO：1反向引物R1：5
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GTTTCMACAATGTAGGACCATG
‑3’
，SEQ ID NO：2；流感病毒N1型：正向引物F2：5
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AGACCTTGYTTCTGGGTTGA
‑3’
，SEQ ID NO：4反向引物R2：5
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ACCGTCTGGCCAAGACCA
‑3’
，SEQ ID NO：5；流感病毒H3型：正向引物F3：5
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ATGGTTGGGAGGGAMTG
‑3’
，SEQ ID NO：7反向引物R3：5
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TGCTGCTTGRGTGCTT
‑3’
，SEQ ID NO：8；流感病毒N2型：正向引物F4：5
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GTCCAACYCTAAGTCCAA
‑3’
，SEQ ID NO：10反向引物R4：5
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RCCACAAAACACAACAATAC
‑3’
，SEQ ID NO：11。2.根据权利要求1所述的检测四种流感病毒亚型用的引物，其特征在于：所述四对引物的病毒核酸变异位点均使用简并碱基，R为A/G，M为A/C，Y为C/T。3.一种检测四种流感病毒亚型用的探针，包括四条探针P，其特征在于：四条探针P的碱基序列表示如下：流感病毒H1型：探针P1：5
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TexRed
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GGTAAATGTAACATTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪海波，陈新彬，黄玉湘，梁艺，林少娟，苏影，祝琰，刘亚平，
申请(专利权)人：珠海国际旅行卫生保健中心拱北海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：