一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体公开了一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法。本发明专利技术的修饰的棒状杆菌属微生物相比于未修饰的微生物，其假定膜蛋白的表达降低或不表达，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。本发明专利技术通过使假定膜蛋白失活，提高了菌株生产苏氨酸的产量。为苏氨酸的生产提供了一个新的思路。为苏氨酸的生产提供了一个新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体地说，涉及一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法。

技术介绍

[0002]L
‑
苏氨酸(L
‑
Threonine)，化学名称为β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L
‑
苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230.)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163.)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increase l
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327.)。
[0004]但目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在苏氨酸合成路径中，关于非必需基因敲除等方面的报道较少。关于基因组最小化的研究主要集中在基因组简化是否会造成菌株生长缓慢、营养缺陷以及简化后是否有利于进行基因改造等方面。目前尚未有关于基因组简化与苏氨酸产量相关的报道。因此，有必要对谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸进行进一步研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是通过降低假定膜蛋白的表达使菌株生产苏氨酸的能力得到提升，从而提供一种产苏氨酸(L
‑
苏氨酸)菌株及其构建方法与应用。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其假定膜蛋白的表达降低或不表达，且所述微生物相比于
未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。优选地，假定膜蛋白在NCBI上的参考序列编号为CAF21557，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0008]进一步地，所述微生物体内假定膜蛋白的表达降低或不表达是通过降低编码假定膜蛋白基因的表达或敲除内源的编码假定膜蛋白的基因来实现的。
[0009]可以采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码假定膜蛋白基因的表达或敲除内源的编码假定膜蛋白的基因。
[0010]进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成相关的酶的活性增强和/或降低；其中，活性增强的与所述苏氨酸合成相关的酶选自天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶中的至少一种；活性降低的与所述苏氨酸合成相关的酶选自4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶和柠檬酸合成酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_011013497.1、WP_011014465.1、FOB93_04945、WP_003854900.1、WP_011014792.1、WP_011013914.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
[0011]优选地，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
[0012]①
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶活性增强的微生物；
[0013]②
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
[0014]③
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和/或天冬氨酸氨基转移酶活性增强的微生物；
[0015]④
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强的微生物；
[0016]⑤
假定膜蛋白的表达降低或不表达，高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强且4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶活性降低的微生物；
[0017]⑥
假定膜蛋白的表达降低或不表达，高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强且4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶和/或柠檬酸合成酶活性降低的微生物。
[0018]所述微生物体内苏氨酸合成相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～5)，或任选的组合实现的：
[0019]1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；
[0020]2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；
[0021]3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；
[0022]4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其假定膜蛋白的表达降低或不表达，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内假定膜蛋白的表达降低或不表达是通过降低编码假定膜蛋白基因的表达或敲除内源的编码假定膜蛋白的基因来实现的。3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码假定膜蛋白基因的表达或敲除内源的编码假定膜蛋白的基因。4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成相关的酶的活性增强和/或降低；其中，活性增强的与所述苏氨酸合成相关的酶选自天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶中的至少一种；活性降低的与所述苏氨酸合成相关的酶选自4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶和柠檬酸合成酶中的至少一种。5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下
①
～
⑥
中的任一种：
①
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶活性增强的微生物；
②
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性增强的微生物；
③
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和/或天冬氨酸氨基转移酶活性增强的微生物；
④
假定膜蛋白的表达降低或不表达且高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强的微生物；
⑤
假定膜蛋白的表达降低或不表达，高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强且4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶活性降低的微生物；
⑥
假定膜蛋白的表达降低或不表达，高丝氨酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶和/或变异链球菌来源的NADP依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶活性增强且4
‑
羟基四氢吡啶二羧酸合酶和/或柠檬酸合成酶活性降低的微生物。6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内苏氨酸合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，刘涛，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：