产苏氨酸基因工程菌的构建方法技术

本发明专利技术提供一种产苏氨酸基因工程菌的构建方法。本发明专利技术通过降低2

【技术实现步骤摘要】
产苏氨酸基因工程菌的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物工程
，具体地说，涉及一种产苏氨酸基因工程菌的构建方法。

技术介绍

[0002]L
‑
苏氨酸(L
‑
Threonin)，化学名称为β
‑
羟基
‑
α
‑
氨基丁酸，分子式C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L
‑
苏氨酸为必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等领域。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB)以及苏氨酸合酶(thrC)编码。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷氨酸棒状杆菌的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230)、lysC基因(Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163)。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increase l
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327)。
[0004]目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在其合成途径中，有关前体供应等方面的报道较少。且现有报道仅对苏氨酸合成途径做了初步研究，并未形成系统。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是通过降低2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的活性或失活该酶来增强苏氨酸合成前体草酰乙酸的供应，提高菌株生产苏氨酸的能力，从而提供一种产苏氨酸(L
‑
苏氨酸)的基因工程菌的构建方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种修饰的棒状杆菌属微生物，所述微生物相比于未修饰的微生物，其2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。优选地，2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2在NCBI上的参考序列编号为WP_011013797.1，或与其相似性为90％的氨基酸序列。
[0007]进一步地，所述微生物体内2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的活性降低或丧失是通过降低编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2基因的表达或敲除内源的编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的基因来实现
的。
[0008]可以采用诱变、定点突变或同源重组等方法来降低编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2基因的表达或敲除内源的编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的基因。
[0009]进一步地，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强；或，
[0010]所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；或，
[0011]所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强，同时其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；
[0012]其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_003855724.1、WP_003854900.1、WP_011014964.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
[0013]所述与苏氨酸合成相关的竞争途径的酶选自二氨基庚二酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶中的至少一种；优选地，它们在NCBI上的参考序列编号分别为WP_011015254.1、WP_003862033.1、WP_011014792.1、WP_003862874.1、NP_601948.1，或与上述参考序列相似度为90％的氨基酸序列。
[0014]优选地，所述微生物为如下
①
～
⑦
中的任一种：
[0015]①2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性至少一个增强的微生物；
[0016]②2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强的微生物；
[0017]③2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时二氨基庚二酸脱氢酶活性降低或丧失的微生物；
[0018]④2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时苏氨酸脱水酶活性降低或丧失的微生物；
[0019]⑤2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶活性降低或丧失的微生物；
[0020]优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种修饰的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修饰的微生物，其2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的活性降低或丧失，且所述微生物相比于未修饰的微生物具有增强的苏氨酸生产能力。2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的活性降低或丧失是通过降低编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2基因的表达或敲除内源的编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的基因来实现的。3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于，采用诱变、定点突变或同源重组的方法来降低编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2基因的表达或敲除内源的编码2
‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2的基因。4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强；或，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；或，所述微生物与未修饰的微生物相比，其体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性增强，同时其体内与苏氨酸合成相关的竞争途径或降解途径的酶活性降低或丧失；其中，所述与苏氨酸合成途径相关的酶选自天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合酶中的至少一种；所述与苏氨酸合成相关的竞争途径的酶选自二氨基庚二酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶中的至少一种。5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物为如下
①
～
⑦
中的任一种：
①2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性至少一个增强的微生物；
②2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强的微生物；
③2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时二氨基庚二酸脱氢酶活性降低或丧失的微生物；
④2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时苏氨酸脱水酶活性降低或丧失的微生物；
⑤2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶活性降低或丧失的微生物；优选地，4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶活性降低是指4
‑
羟基
‑
四氢二吡啶羧酸合酶的起始密码子ATG中的A突变为G；
⑥2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时乙酸激酶活性降低或丧失的微生物；
⑦2‑
甲酰
‑
柠檬酸合酶2活性降低或丧失且天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合酶活性增强，同时磷酸转乙酰酶活性降低或丧失的微生物。6.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物体内苏氨酸合成途径相关的酶的活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，周彤彤，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：