一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，涉及一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，涉及一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]草铵膦(glufosinate ammonium,phosphinothricin简称PPT)，化学名称为(D，L)
‑2‑
氨基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界三大除草剂(百草枯，草甘膦，草铵膦)之一。目前，随着转基因草甘膦耐受作物的开发、百草枯的禁用以及杂草对草甘膦的抗性日益增强等因素，凭借其优异的除草性能和较小的药害副作用，草铵膦产品将具有较大市场开发潜力和广阔的应用前景。
[0003]草铵膦是一种外消旋混合物，有L
‑
型和D
‑
型两种对映异构体，但是在除草中起作用的只有L
‑
型的草铵膦，而D
‑
型对映异构体则无除草活性。因此，D
‑
型草铵膦转变成L
‑
型草铵膦将大大减少原药用量，这对于提高产品经济性、减少农药使用量、减轻环境压力都具有十分重要的作用。
[0004]L
‑
草铵膦主要通过手性拆分、化学合成、生物催化制得。其中手性拆分需要使用昂贵的拆分试剂，单次拆分率低，工艺较复杂。化学合成反应步骤较多，反应收率低，环境污染大。而生物催化底物选择性强、反应条件温和、收率高等优点，展现了其替代传统化学合成的潜力。研究较多的路线是以D
‑
草铵膦为原料，经过D
‑
氨基酸氧化酶催化D
‑
草铵膦得到L
‑
草铵膦的前体2
‑
羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，再经过转氨酶或氨基酸脱氢酶催化作用得到L
‑
草铵膦。
[0005]目前，D
‑
氨基酸氧化酶活力均较低，用酶成本高居不下。因此，进一步提高D
‑
氨基酸氧化酶活力是生物催化法急需解决的问题。基于此目的，本专利技术以Rhodotorulagracilis来源的D
‑
氨基酸氧化酶(RgDAAO)进行突变筛选，进一步提高了酶活力和转化率，使之更适用于工业应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的是提供D
‑
氨基酸氧化酶突变体，以能够使突变体较野生型D
‑
氨基酸氧化酶具有更高的活力和转化率，使之更适用于工业应用。
[0007]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体，是对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行突变，突变的氨基酸位点为S3R、N54I、T56N、F58K、Q98R和M213S中的至少一个。
[0008]进一步地，突变体包括以下5种中的任意一种：
[0009]N54I+M213S；
[0010]T56N+F58K+M213S；
[0011]N54I+T56N+F58K+M213S；
[0012]N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；
[0013]S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；
[0014]优选：T56N+F58K+M213S；
[0015]N54I+T56N+F58K+M213S；
[0016]N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；
[0017]S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；
[0018]进一步优选：N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；
[0019]S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S。
[0020]本专利技术的第二个目的是提供编码前述D
‑
氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的D
‑
氨基酸氧化酶突变体较野生型D
‑
氨基酸氧化酶具有更高的活力和转化率，使之更适用于工业应用。
[0021]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供编码前述D
‑
氨基酸氧化酶突变体的多核苷酸。
[0022]本专利技术的第三个目的是提供一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体的应用：用于催化D
‑
草铵膦反应，以能够更好的制备L
‑
草铵膦前体2
‑
羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。
[0023]为实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体的应用，所述的应用是在反应体系中，用前述的D
‑
氨基酸氧化酶突变体催化D
‑
草铵膦反应，制备2
‑
羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。
[0024]进一步地，100ml反应体系中，D
‑
氨基酸氧化酶重组菌添加量为20
‑
40g/L。
[0025]进一步地，100ml反应体系中，过氧化氢酶活力100
‑
500U。
[0026]进一步地，反应体系中，DL
‑
草铵膦浓度为5％
‑
15％。
[0027]进一步地，反应温度为28
‑
33℃，反应时间为5
‑
13h。
[0028]进一步地，反应pH为8.0
‑
9.0。
[0029]进一步地，反应搅拌转速为150
‑
200r/min。
[0030]本专利技术的有益效果在于，利用本专利技术的D
‑
氨基酸氧化酶突变体，显著提高了酶的活力和转化率，其活力提高倍数最高达5400倍，转化率更是达到了49.8％(理论值50％)，D
‑
草铵膦几乎完全转化。利用本专利技术的D
‑
氨基酸氧化酶突变体制备L
‑
草铵膦前体2
‑
羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸能显著降低用酶成本，缩短反应时间。由于其更佳的活性和转化性能，将给转化体系中带来或产生更少的杂质，给下游处理带来便利。更适用于工业应用。
附图说明
[0031]图1为D
‑
氨基酸氧化酶催化D
‑
草铵膦的反应示意图。
具体实施方式
[0032]以下结合实施例对本专利技术作出进一步的说明，而非限制本专利技术。
[0033]其中D
‑
氨基酸氧化酶及其突变体的酶活力的测定方法如下。
[0034]100mM甘氨酸缓冲液pH9.0中含100mM的DL
‑
草铵膦、1mM 4
‑
AAP、2.5mM TBHBA、1.5U/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑
氨基酸氧化酶突变体，其特征在于：是对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行突变，突变的氨基酸位点为S3R、N54I、T56N、F58K、Q98R和M213S中的至少一个。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变体包括以下5种中的任意一种：N54I+M213S；T56N+F58K+M213S；N54I+T56N+F58K+M213S；N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；优选：T56N+F58K+M213S；N54I+T56N+F58K+M213S；N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；进一步优选：N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S；S3R+N54I+T56N+F58K+Q98R+M213S。3.一种编码权利要求1或2所述的D
‑
氨基酸氧化酶突变体的核苷酸。4.权利要求1
‑
3所述的D
‑
氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，许岗，周晶辉，赵强，赵士敏，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：