鼠ＲＡＮＫ胞外蛋白晶体制造技术

本发明专利技术提供了一种鼠ＲＡＮＫ胞外蛋白晶体，以及该ＲＡＮＫ胞外蛋白晶体在医药领域中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质晶体，尤其涉及一种鼠RANK胞外蛋白晶体，本专利技术还提供 了一种制备RANK胞外蛋白晶体的方法，以及该RANK胞外蛋白晶体在医药领域中的应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF)家族中的细胞因子在诸如炎症反应、器官发生、宿主防御、 自身免疫和细胞凋亡等多种生物功能中扮演着重要的角色。这些生物调节因子是通过受 体-配体相互作用，从而引发细胞内的信号传递以及细胞表型的改变而发挥相应的生理作 用的。作为TNF家族成员的RANKL以及其受体RANK在生物体内的多种活动中扮演着重要 的角色，其对于骨的重塑过程起到了重要的调节作用，并且RANK以及RANKL分子之间的相 互作用还可调节T细胞/树突状细胞的信号传导、树突状细胞的存活以及淋巴组织的发育， 近年来受到了广泛的关注。在人体骨的重塑过程中，破骨细胞是骨重塑的“启动子”，成骨细胞是骨重塑的“调 节者”，骨吸收类疾病共同的病理特征为破骨细胞调节异常导致骨形成和骨吸收之间丧失 平衡，因此深入了解破骨细胞的激活机制将对于成功防治骨吸收类疾病的发生有着至关重 要的意义。1997年，几个不同的研究小组发现了肿瘤坏死因子受体-配体超家族新成员骨 保护蛋白(osteoprotegerin，0PG)、RANKL以及RANK ；随后，多项研究相继显示RANKL、0PG 具有调节破骨细胞分化、发育、影响其功能的作用，RANK是RANKL、OPG发挥作用的关键，它 们形成一个骨调节轴，来调节骨的重塑过程。RANKL为一种II型跨膜蛋白，其多为三个单体聚合成的复合体，主要分布在活 化T细胞、骨髓基质细胞及成骨细胞等细胞中，目前认为哺乳动物中存在三种RANKL蛋白 RANKLl、RANKL2、RANKL3，其中前两种为膜结合蛋白，后一种为被分泌到胞外的可溶性蛋白。 人和大鼠的RANKL分子分别包含317、316个氨基酸残基，具有87%的同源性；人类RANKL基 因位于13ql4，其启动子区包含成骨细胞分化的关键转录因子cbaf-Ι的活性。RANKLmRNA 可在多种组织表达，以骨骼和淋巴组织中最高，在骨骼中，RANKL主要表达于骨小梁和骨髓； 在骨髓基质细胞和成骨细胞均可检测到RANKL mRNA。2004年Ito S等人以及国际专利申 请NO. WO 03/014077都披露了 RANKL的三维结构，其全部内容结合于此作为参考。各项研 究表明每一个RANKL单体包括一个夹层结构，其由两个平面反平行β-折叠片层构成。第 一个片层由β _链A”、Α、H、C及F组成，第二个片层由B’、B、G、D及E组成，其中第一片层 为内层β -片层，该片层富含疏水性氨基酸，并通过疏水作用与另外两个RANKL相互结合， 而B’、B、G、D及E链形成外层β -片层，该片层多为带电及极性氨基酸，负责与受体RANK结 合；每一个RANKL单体中的β -夹层结构的一个边缘、链E及F包裹相邻单体的AHCF β-片 层的内部疏水层从而形成RANKL三聚体结构。RANKL三聚体的晶体结构特征是具有PZppi的空间群，晶胞参数为a=65.3A±0.2A，b=82.0A 士0.2A,C=99.5人士 0.2Α,以及空间群R3，胞晶为a=b 二 150.6A±0.2A，C= 139.5入士0.2入。其形状就像被截平了的锥形，靠近膜的一端宽于远端的顶点处。RANKL三聚体高55 A,底部直径约为55 A,顶点处的直径约为35 A。RANK是RANKL的受体，属于TNF受体家族，是一种I型跨膜蛋白，鼠RANK分子在破 骨细胞前体细胞和成熟破骨细胞内表达量较高。RANK基因定位于18q22. 1，其编码的蛋白 质在体内以跨膜蛋白型存在，其表达于单核-巨噬细胞系、破骨细胞前体细胞、T淋巴细胞、 B淋巴细胞、树突状细胞等，表达于破骨细胞前体细胞膜表面的RANK介导RANKL的信号，发 挥调节破骨细胞分化的功能。当配体RANKL与受体RANK的胞外区域结合后，导致了 RANK的激活，活化后的RANK 通过其胞内区域的TRAF结合域与TRAF1、2、3、5、6等蛋白结合，并且通过这些TRAF蛋白激 活细胞内的两条重要的信号通路JNK/SAPK通路和NF κ B信号通路。这两条信号通路的激 活诱导了与破骨细胞分化相关的基因的表达，最终促进了破骨细胞的分化与成熟。而且， 各种骨代谢调节因子、激素参与RANKL-RANK-0PG轴信号的调节。与其它信号途径一样， RANKL-RANK-0PG轴信号也存在正反馈和负反馈调节。1 α，25-(OH)2D3^甲状旁腺素、前列腺 素Ε2、白介素l、IL-6等骨吸收因子分别通过维生素D受体介导通路、蛋白激酶A介导通路、 gpl30/STAT介导通路上调成骨细胞/骨髓基质细胞RANKL mRNA表达；IL_1、TNF_ α分别通 过激活破骨细胞表面的IL-IR和TNFRl加强RANKL信号；TGF-β则可增加破骨细胞表面的 RANK上调RANKL信号。作为RANKL-RANK-0PG信号系统调控破骨细胞分化的中心环节，RANKL与RANK之 间的相互作用及其促使RANK活化的微观机制一直以来是骨吸收类疾病研究领域的热点问 题。其焦点问题之一是RANKL、RANK蛋白以及RANK/RANKL复合体的晶体结构。虽然目前已 经获得了 RANKL蛋白的晶体结构，但是仍然没有获得RANK蛋白以及RANK/RANKL复合体的 晶体结构，正是由于对这些结构的认识不足，所以学者们对于RANKL-RANK-0PG信号体系如 何被调控，以及受调控后RANKL-RANK-0PG执行信号传递的微观机制尚无明确的认识。这严 重影响了有关骨吸收类疾病致病机制的探索以及抗骨吸收药物的研究。分析目前还未获得RANK蛋白以及RANK/RANKL复合体的晶体结构的原因主要有以 下两点1. RANK蛋白较难于制备和纯化。在RANK被发现至今的时间里，一直无RANK蛋白 E. coli表达以及纯化的相关报道。2.相对于包含RANKL在内的TNF蛋白家族成员所具有 的较刚性的结构，包括RANK在内的TNFR蛋白家族成员其结构具有较大的可变性，因而更难 于获得结晶。
技术实现思路
本专利技术涉及一种蛋白质晶体，其中所述晶体包括鼠RANK胞外区域的氨基酸序列。 鼠RANK的胞外区域是指RANK单体N-末端从26位氨基酸至210位氨基酸。本专利技术所提供的晶体由鼠RANK单体链A及单体链B形成的二聚体构成。根据本专利技术所提供的鼠RANK胞外蛋白晶体，该晶体具有空间群PZPP1，晶胞参数为a=39.82 A,b=94.25 A和c=102.42 A。在本专利技术所提供的晶体中，单体链A及单体链B以反向平行形式，即单体链A的N 端对应于单体链B的C端而形成二聚体；该二聚体含有四个CRD，存在于这四个CRD结构域 中的多个二硫键使得单体链A和B形成细长的带状；两个单体的重叠所形成的均方根差为 2.13A,除去溶剂后的二聚体所形成的总面积为3231 A2;由两个单体之间所包含的面积被这两个单体等分；形成的二聚体的长度与RANK单体的长度近似。在本专利技术所提供的晶体中，在所述二聚体中，每个不同的CRD结构域具有不同的 均方根差，相对于Ca原子而言，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胞外区域蛋白的晶体，其中所述晶体包括鼠ＲＡＮＫ胞外区域的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐佩福，刘长振，黄鹏，张世谦，高斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，北京表源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]