利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用植物铝诱导表达基因增加植物抗铝性的方法，该方法利用Ｓｉ６９基因来提高植物的抗铝性。研究表明，通过将Ｓｉ６９基因转化植株，能够显著提高植株的抗铝性。本发明专利技术方法对植物生物量的增加特别是农作物增产有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种利植物铝诱 导表达基因增加植物抗铝性的方法。
技术介绍
铝是自然界含量最多的金属元素,占地壳总质量的7%。其中大部 分在土壤中以氧化铝、硅化钼的形式存在，对植物的生长不够成伤害。 当土壤溶液酸化后(p!K5),铝就会从氧化物或硅酸盐中释放出来，溶 解到土壤中，主要以A产形式存在。A产对植物的胁迫最大，甚至低 浓度(pmol/L )铝离子在酸性条件下就能对植物产生毒害效应[Horst et al. Effect of aluminum on root growth, cell-division rate and mineral element contents in roots of imgw'cw/atof genotypes. ZPflanzenphysiol, 1983， 109: 95-103; Kinraide and Parker,Assessing the phytotoxicity of mononuclear hydroxyl-aluminum. Plant cell Environ, 1989,12:479-487]。铝毒最明显的特征是抑制根的生长，造成植物对 水分和营养吸收的困难。研究者对铝诱导植物抗性基因的表达做了大量的研究。Richard 和S丽den 从铝敏感小麦中分离得到了 7个铝诱导基因，命名wali基因(for wheat aluminum induced )。这些基因编码的蛋白分别与植物类 金属硫蛋白(walil )、苯丙氨酸解氨酶(wali4 )，蛋白酶抑制剂〔wali3, wali5和wali6)及谷氨酰胺合成酶(wali7)具有同源性。另外还有十几个 铝诱导的基因已被分离出来，包括小麦、拟南芥和烟草中的各种基因。 为了研究植物抗铝性的机理，人们利用了转基因技术。De la Fuente等(1997)将细菌(Pseudomonas aeniginosa)的梓檬酸合成酶 基因(CS)在烟草中过量表达，结果转基因烟草的耐铝能力增强， 这是人类首次釆用转基因技术提高植物耐铝特性的尝试。 Anoop等(2003 )将拟南芥 的线粒体柠檬酸合酶CS基因导入油菜中并得到过量表达，结果转基 因植株中CS活性提高，植株的耐铝能力增加。 Delhaize等(2004 )将小麦根尖 苹果酸分泌的转运蛋白基因ALMT1在大麦中异源表达，转ALMT1 基因的大麦植株其苹果酸分泌的能力和耐铝能力都有显著提高 。 cDNA，称 之为Si69基因，它来自于谷子未成熟种子的cDNA文库，该cDNA 与植物抗铝性有关，
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用植物受铝诱导的基因来提高植物抗 铝性的方法。本专利技术从谷子(&to〃'a /to//ca Beauv. Var. 3661， 3662 )未成熟种 子cDNA文库中筛选得到 一个cDNA克隆，称之为Si69基因。该cDNA 的序列长度为1061 bp，为双链核酸类型，线性，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。通过三大数据库的检索，发现Si69cDNA编码蛋白与 水稻(NP—001051238 AAP12992)、拟南芥(NP—188925 NP—199196)、 小盐芥(AAM19711)和小麦(AAC37416.1)同源性分别为84%, 58%, 50%， 50%。它们都具有一共同特点蛋白结构中存在一保守的wali7 结构域，但功能未知。Southern印迹研究表明该基因在谷子基因组中 以单拷贝存在。Northern印迹分析5V砂基因的表达模式，表明其在 谷子谷子幼苗、根、茎、叶、幼穗及未成熟种子等组织中均可检测到 其转录产物的存在。RT-PCR和荧光定量PCR研究表明^'"基因的 表达受到铝的诱导。进一步，本专利技术构建含Si69的表达载体，并将其转化植物，用 以考察转基因植物的抗铝性。在本专利技术实施方案中，构建了含有S/M cDNA的拟南芥表达载 体，其表达盒是由花椰菜花叶病毒35S启动子和来自胭脂碱合成酶 (nos)基因的3转录终止区域构成，选择标记基因为新霉素嫌酸转 移酶II(NPTII)。所述的表达载体优选的是重组质粒pBI121-Si69，其 中S/仰cDNA正向插入并且在35S启动子驱动下。本专利技术将上述含有所述&69 cDNA的重组表达载体转化植物， 如拟南芥，获得了抗铝性提高的转基因植物。在本专利技术实施方案中，将含有所述cDNA的表达载体转化拟南 芥，获得的植株抗铝性提高，根伸长受铝抑制减弱。本专利技术找到了与植物受钼诱导的cDNA(称为^'卯基因)，将所述 的基因转化到植物中可使植物抗铝性增加。利用本专利技术方法，可以显 著提高植物的抗铝性，从而对植物生物量的增加特别是农作物增产有 重要意义。附图说明图1显示的是来自谷子的&69 cDNA序列，以及推导的氨基酸 序列。图2显示的是含有5V砂cDNA的拟南芥表达载体构建过程图。 图3显示的是T3代转基因拟南芥Western杂交。 图4显示的是拟南芥根部苏木静染色图，其中左上图和右上图分 别为野生型和转基因植株在20^MA1处理下的染色图，左下图和右下 图分别是野生型和转基因植株在50|aM Al处理下的染色图(lOOpm标尺)；图5显示的是拟南芥根尖扫描电镜图(放大倍数上层xl.00K 30pm标尺；下层:x2.50K 12.0lim标尺)图6显示的转基因拟南芥和野生型的根尖伸长及MDA含量情况。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的 限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例l植物受铝诱导基因S/69的克隆选取谷子授粉后5、 7及12天的未成熟种子，材料混合后，提取 总RNA,磁珠法富集mRNA(Promega)，釆用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA,双链cDNA补平后，连接五"RI adapter,将其构建至人ZAPII载体上，使用ZAP - cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit( Stratagene公司)进行体外包装。包装完毕后，加入 SM溶液和氯仿，离心后，上清即为构建好的文库。取lpl文库上清 液进行滴度测定，结果表明构建的文库容量为2xl07pfo/ml。原始文 库构建完成后，扩增一次备用。利用酵母双杂交(Clontech公司)筛选cDNA表达文库，技术 为公知技术，经过筛选后，得到阳性克隆。进行序列测序,测序结果如SEQ ID No. 1所示，称之为S/65>。 实施例2植物受铝诱导基因&"的克隆1、 植物组织总RNA的提取(1) 将4 ml苯酸与8ml RNA提取缓冲液混匀后，放在65°C 水洛预热；(2) 取谷子叶片约5g，加入液氮和少量石英砂，研钵中充分 研磨成粉末，装入50ml离心管；(3 )将预热的提取混合液加入含有植物材料粉末的离心管中， 与植物材料充分混匀，室温抽提10min;再加入4ml氯仿，继续抽 提本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｓｉ６９基因在增加植物抗铝性中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于静娟，赵琳娜，赵倩，敖光明，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]