一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片制备及其检测方法，所述的病原体包括鼠疫耶尔森菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ）、炭疽芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、葡萄球菌肠毒素Ｂ（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ，ＳＥＢ）、蓖麻毒素（ｒｉｃｉｎ）和重症急性呼吸道综合症冠状病毒（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）。通过大量试验证明：蛋白质悬浮芯片制备方法简便、快捷；检测效果快速、准确、灵敏度高、检测范围宽、特异性强；对于实际环境样品适用性好。同时本发明专利技术为建立多功能、多指标、高通量、标准化的病原体复合检测要求奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片制备及其才企测方法，所述的病原体包括细菌、细菌芽；包、细菌毒素、才直物毒素和病毒，分别选以鼠疫耶尔森菌(fem'/ /a / e^/s)、炭疽芽胞杆菌(勘"7/iA^ a/2^ rac/力、葡萄球菌肠毒素B( staphylococcal enterotoxinB, SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)为代表。
技术介绍
进入20世纪以后，生物威胁有增无减。1996年日本EHEC 0157: H7疫情、2003年全球SARS疫情、2001年美国炭疽邮包事件、1995年美国明尼苏达州蓖麻毒素事件等，人类面临生物威胁的事例多不胜数。人为生物恐怖事件随时有发生的可能，更引起人们对生物威胁的恐惧。而新发传染病种类繁多，生物恐怖因子多种多样，包含细菌、病毒、毒素等，威胁人类健康的生物因子至少有30多种。由于针对不同病原体袭击的防护和处理各不相同， 一线工作者既要保护自身安全，也要做到科学处置，因此病原体的快速鉴定识别是应对生物威胁的首要任务。目前，基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论发展起来的病原体快速检验方法可以分别对环境样本中的生物威胁因子进行定性和定量检测。定性检测技术有常规的分离培养、血清学方法等，鉴定结果虽然准确可靠，但耗时长，每次只能确定或排除一种病原;徵生物，往往延误紧急突发公共卫生事件的处置。快速检测技术主要是以病原体遗传物质核酸为基础的检测方法如核酸分子杂交、PCR、多重PCR等，和基于病原体核酸或抗原检测的生物传感器技术，如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等。其中，利用多重PCR方法进行单一或多种致病菌的试验屡有报道。微生物定量检测方法包括常规的平板法、最大可能数(MPN)法、细胞计数法和阻抗计法等，也存在耗时长，每次只能对一种病原体进行定量检测的缺陷；微生物定量检测的新技术主要是实时定量PCR,近年来在多种病原微生物的定量检测中得到广泛应用，但缺陷是只能检测病原菌的核酸，不能检测毒素蛋白。炭疽芽孢杆菌a/^力rac/力是引起人兽共患病-炭疽的病原菌，为革兰氏阳性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通过呼吸道、消化道、皮肤接触感染人类， 一般在接触后7天出现感染症状，以皮肤型炭疽最常见。吸入大量炭疽芽孢(大于8000个)可引起吸入型炭疽，也称肺炭疽。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，致污染可持续存在，在军事上一直被列为是头号生物战剂之一。在一些国家曾生产并作为武器储存，而今又成为恐怖袭击选用剂，对人类造成新的更大的威胁。炭疽芽孢杆菌的抗原包括菌体抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢杆菌的生存、增殖不需特殊条件设备及环境，在土壤中就可增殖，人工大量培养及使之变为芽孢十分容易。由于芽孢独特的生物学性状和危害，对炭疽芽孢的快速定量检测意义重大。本专利技术选择炭疽芽孢作为产芽孢的细菌及其芽孢的代表建立悬浮芯片检测模型。鼠疫耶尔森菌(/e"/z7/a / es"s)可引起动物疫源性烈性传染病-鼠疫，其天然宿主是啮齿类动物。鼠疫往往是由于接触带菌的啮齿类动物或被染菌的蚤类吓咬而发病。历史上记载过三次鼠疫的世界性大流行，造成人类生命和财产的巨大损失。在我国鼠疫被列为曱类传染病。作为一种烈性传染病，鼠疫具有传播快、病死率高等特点，是经典的生物战剂。目前，以生物武器形式出现的鼠疫最有可能发生的是肺鼠疫，该病人间传播更为迅速。鼠疫菌的快速检测对控制鼠疫的扩散蔓延至关重要。本专利技术选择鼠疫菌作为细菌的代表建立检测模型。蓖麻毒素(ricin toxin，以下简称ricin)是蓖麻籽中含有的一种高毒性的糖蛋白，蓖麻毒素经呼吸道吸入、消化道摄入和肌肉注射均可致人中毒。人经口致死量0. 15-0. 2g，静脉注射致死量20mg，小鼠腹腔LD50约为3. Opg/kg。 ricin毒性大，性质稳定，来源较广，提取成本低廉。随着多个恐怖组织和极端分子研制和使用蓖麻毒素的消息接连进入媒体，这种致命的、毒性极强的生物毒素被美国等国列为最有可能被用做恐怖袭击的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速侦检方面，美国、欧盟等国家一直十分重视，已建立了供实验室和现场使用的方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学分析技术、生物传感器技术以及胶体金免疫 层析方法等；我国台湾地区也建立了检测蓖麻毒素的EL ISA和胶体金免 疫层析方法及其配套诊断试剂。建立蓖麻毒素的快速定量试剂具有重要 现实意义。同时，本专利技术选择ricin作为植物毒素的代表建立检测模型。 金黄色葡萄球菌肠毒素B (staphylococcal enterotoxin B SEB) 是引起食物中毒的主要致病因素，也是重要的生物恐怖战剂。SEB的检测 研究在平时和战时都有重要意义。本专利技术选择SEB作为细菌毒素的代表 建立检测模型。重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)引起本世纪第 一种在全球^ 暴发的烈性传染病，SARS引起的恐慌至今人们仍记忆犹新。SARS-CoV为 单股正链RNA病毒，属巢状病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属。根据血 清型，冠状病毒属主要分为3个型，包括多种哺乳动物冠状病毒和鸟感 染性支气管炎病毒。虽然2002年爆发的SARS已被成功控制，但由于病 毒的变异及其高度的传染性，SARS存在着再度复发的可能，因此对SARS 的研究不容忽视。专利技术选择SARS-CoV作为病毒的代表建立检测模型。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(1 iquid array, liquid chip),是2 0世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术， 利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋 白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、 核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮 芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种 独特的色彩编号，每颗微球大小约5. 5jam，可依不同研究目的如免疫分 析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的 而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物 在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微 细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两 道激光， 一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确 定检测项目； 一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测 待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光 所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发 的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至^:十种病原。悬 浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测 时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技 术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用微球悬浮芯片复合检测炭疽芽孢、鼠疫菌、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ　Ｎ蛋白、蓖麻毒素和ＳＥＢ多种类病原体中的一种或多种的检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在９６孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：　（１）向孔加入含已包 被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；　（２）加入待测样品，孵育后清洗；　（３）加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；　（４）加入ＳＡ－ＰＥ，孵育后清洗；　（５）加入检测缓冲液后混匀；　（６）用悬浮芯片系 统读取平均荧光强度（ＦＭＩ）数值并分析数据判定检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，孙肖红，杨宇，胡孔新，张晓龙，杨瑞馥，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]