一种酶法制备鸟苷四磷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备鸟苷四磷酸的方法，涉及鸟苷四磷酸合成技术领域，所述酶法制备鸟苷四磷酸的方法包括以下步骤：1)表达并纯化得到ppGpp合成酶SaRelP；2)将步骤1制得的ppGpp合成酶SaRelP与反应底物GDP在缓冲液环境中混合，再加入磷酸供体ATP发生反应，反应结束后沉淀蛋白，冻干，将粉末重新溶解于水；3)利用高效液相色谱(HPLC)对步骤2中重新溶解的溶液进行分离，纯化得到ppGpp。本发明专利技术提供一种酶法合成路线，该路线能快速、高效、成本较低地制得目标产物ppGpp。合成路线中使用的原料ATP和GDP均容易获得且成本较低，酶法合成过程简便，用时较短，分离方法简便，最终产率较高。最终产率较高。最终产率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备鸟苷四磷酸的方法


[0001]本专利技术涉及鸟苷四磷酸合成
，尤其涉及一种酶法制备鸟苷四磷酸的方法。

技术介绍

[0002]鸟苷四磷酸(ppGpp)是一种重要的生理活性物质，是几乎所有细菌使用的一种应激反应警报因子，其由于功能的多效性被称为魔斑。在氨基酸匮乏时，瞬时积累的鸟苷四磷酸能够作为信使调控下游数百个基因的表达，导致DNA复制受阻、核糖体RNA合成抑制等多种生理变化。近年来，人们发现ppGpp在植物中同样能够发挥作用，ppGpp在高等生物中的作用也将成为未来的一个研究重点。因此，一方面，相关的科学研究过程中需要鸟苷四磷酸作为研究的材料。另一方面，在实际应用中，鸟苷四磷酸也有潜力应用于人为调控微生物某些生理过程如促进微生物发酵高产等。
[0003]1974年，A.Simoncsits J.Tomasz首次发表了ppGpp的化学合成方法，但工艺复杂，产率只有约5％。2018年，SEIO KOHJI等人提出了更加高效的鸟苷四磷酸及其中间体的合成方法(专利申请号US
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2021094980
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A1)。但目前鸟苷四磷酸的供应商家仍然较少，且价格十分昂贵。在科学研究中，稳定和相对廉价的鸟苷四磷酸来源是十分重要的。因此，利用酶法快速、高效、实惠地合成鸟苷四磷酸成为一种选择。
[0004]生物体内的ppGpp合成由一类高度保守且广泛分布的RSH(RelA
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SpoT Homologs)家族的蛋白质实现。它们能够以GDP/GTP为底物，将ATP上β，γ
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磷酸基团转移到GTP或GDP的3
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OH，从而合成ppGpp/pppGpp。RSH蛋白基于它们的大小和结构域可以分为两类，一类是长RSH蛋白，具有合成(SD)和水解(HD)两种功能的结构域。另一类是短的单结构域RSH蛋白，仅具有合成酶或者水解酶的活性。RelA和SpoT是目前研究最为深入的两种RSH蛋白，属于长RSH蛋白，RelA的功能实现依赖于核糖体，SpoT的功能实现则被证明与ACP相关。近年来，也有许多短RSH蛋白被报道，例如枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中的RelP和RelO、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus中的RelP等。
[0005]因此，本专利技术旨在提供一种酶法合成路线，该路线能快速、高效、成本较低地制得目标产物ppGpp。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是ppGpp的化学合成方法工艺复杂、成本昂贵，供应商家较少，并且常作为定制产品。当在科学研究需要使用ppGpp时，会面临材料价格高昂或者购买渠道少的情况。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种酶法快速、高效、实惠地合成鸟苷四磷酸的方法，包括以下步骤：
[0008]1.表达并纯化得到ppGpp合成酶SaRelP；
[0009]2.将步骤1制得的ppGpp合成酶SaRelP与反应底物GDP在缓冲液环境中混合，再加
入磷酸供体ATP发生反应，反应结束后沉淀蛋白，冻干，将粉末重新溶解于水；
[0010]3.利用高效液相色谱(HPLC)对步骤2中重新溶解的溶液进行分离，纯化得到ppGpp。
[0011]优选地，还包括利用超高效液相色谱质谱联用UPLC
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MS对步骤3所得ppGpp进行鉴定，并对ppGpp进行定量。
[0012]优选地，所述ppGpp合成酶SaRelP来源于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的RelP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]优选地，所述ppGpp合成酶SaRelP的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]优选地，ppGpp合成酶SaRelP的表达并纯化步骤为：将ppGpp合成酶SaRelP的核苷酸序列和6个组氨酸标签插入到pET28a的XbaI/BamHI位点，得到pET28a
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SaRelP，将所述质粒导入E.coli Bl21(DE3)，使用所述E.coli Bl21(DE3)超表达SaRelP
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His，经过镍柱亲和层析和分子筛层析两步纯化后获得ppGpp合成酶SaRelP。
[0016]优选地，步骤2中所述缓冲液含有10
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50mM HEPES，150
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300mM NaCl，3
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10mM MgCl2，2
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10uM ZnSO4和5％
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10％甘油。
[0017]优选地，所述步骤2中ppGpp合成酶SaRelP的摩尔浓度为200
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500nM，GDP的摩尔浓度为100
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250μM，ATP的摩尔浓度为0.5
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2mM。
[0018]优选地，所述步骤2中反应体系的pH为7.5
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8.5，反应温度为30
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37摄氏度，反应时间30分钟
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4小时。
[0019]优选地，所述沉淀蛋白质的有机试剂为甲醇，甲醇体积为反应体系的1
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2倍。
[0020]优选地，所述高效液相色谱条件如下：色谱柱：反相C18柱；流动相：包括流动相A与流动相B；所述流动相A为甲醇或乙腈，所述流动相B为含有10mM乙酸铵和0.02％氨的水溶液；洗脱条件为流动相A：流动相B＝3
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8：92
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97；检测器为DAD检测器，检测波长为250～260nm。
[0021]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0022]本专利技术提供一种酶法合成路线，该路线能快速、高效、成本较低地制得目标产物ppGpp。合成路线中使用的原料ATP和GDP均容易获得且成本较低，酶法合成过程简便，用时较短，分离方法简便，最终产率较高。
[0023]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0024]图1是SaRelP的纯化结果。其中图1a为SaRelP的SDS
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PAGE分析；图1b为SaRelP在superdex 200Increase SEC层析柱分析结果。
[0025]图2是酶法合成且经过纯化的鸟苷四磷酸和鸟苷四磷酸标准品的高效液相色谱结果。其中，图2a为酶法合成且经过纯化的鸟苷四磷酸的高效液相色谱结果。图2b为鸟苷四磷酸标准品的高效液相色谱结果。
[0026]图3是酶法合成且经过纯化的鸟苷四磷酸的质谱结果。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术进行描述，但本专利技术的保护范围并非仅限于此：
[0028]实施例1：鸟苷四磷酸的酶法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成鸟苷四磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)表达并纯化得到ppGpp合成酶SaRelP；2)将步骤1制得的ppGpp合成酶SaRelP与反应底物GDP在缓冲液环境中混合，再加入磷酸供体ATP发生反应，反应结束后沉淀蛋白，冻干，将粉末重新溶解于水；3)利用高效液相色谱(HPLC)对步骤2中重新溶解的溶液进行分离，纯化得到ppGpp。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：步骤4)利用超高效液相色谱质谱联用UPLC
‑
MS对步骤3所得ppGpp进行鉴定，并对ppGpp进行定量。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ppGpp合成酶SaRelP来源于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的RelP，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ppGpp合成酶SaRelP编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述ppGpp合成酶SaRelP的表达并纯化步骤为：将ppGpp合成酶SaRelP的核苷酸序列和6个组氨酸标签插入到pET28a的XbaI/BamHI位点，得到pET28a
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SaRelP，将所述质粒导入E.coli Bl21(DE3)，使用所述E.coliBl21(DE3)超表达SaRelP
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His，经过镍柱亲和层析和分子筛层析两步纯化后获得ppGpp合成酶SaRelP。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑舰艇，王逸群，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：