一种ESKAPE病原菌快速检测方法及系统技术方案

本发明专利技术属于病原菌检测技术领域，公开了一种ESKAPE病原菌快速检测方法及系统，所述ESKAPE病原菌快速检测方法包括：进行扩增；进行cas12a反应；进行荧光/试纸条检测；所述ESKAPE病原菌快速检测方法还包括ESKAPE病原菌种属特异性基因分析，其中铜绿假单胞菌特异性序列为SEQ ID NO：1，鲍曼不动杆菌特异性序列为SEQ ID NO：2。本发明专利技术提供的ESKAPE病原菌快速检测方法，1小时内即可完成，检测成本为100～150元，不需要依赖机器或仅需紫外灯，检测灵敏度高，对技术要求较小，能够实现POCT检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
一种ESKAPE病原菌快速检测方法及系统


[0001]本专利技术属于病原菌检测
，尤其涉及一种ESKAPE病原菌快速检测方法及系统。

技术介绍

[0002]目前，ESKAPE病原菌正在威胁人类健康。预计在2050年，全球每年100万人死于ESKAPE感染。感染的早期诊断可以挽救无数的肢体和生命，因此，早期快速诊断意义重大。目前使用的诊断方法具体见表1。
[0003]但是，现有ESKAPE病原菌的诊断方法检测时间长，成本高，仪器依赖度高，且对技术要求也较高。因此，亟需进行基于CRISPR
‑
cas12a技术的ESKAPE病原菌快速检测技术的研发。
[0004]表1目前使用的诊断方法
[0005][0006]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：传统核酸检测技术采用普通PCR、荧光定量PCR等，现有ESKAPE病原菌的传统细菌培养、高通量测序等诊断手段需要的检测时间长，成本高，仪器依赖度高，且对生物分析等技术要求较高。
[0007]解决以上问题及缺陷的难度为：每种ESKAPE病原体微生物的核酸分子序列独特，需设计出针对特定病原菌的核酸分子检测序列。对于早期感染的样本，提升检测灵敏度。
[0008]解决以上问题及缺陷的意义为：本领域需要开发一种快速、灵敏、高特异ESKAPE病原菌适用于现场核酸检测的方法，以应对临床病原菌感染早期诊断困难的问题。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种ESKAPE病原菌快速检测方法及系统，尤其涉及一种基于CRISPR
‑
cas12a技术的ESKAPE病原菌快速检测方法及系统。
[0010]本专利技术是这样实现的，一种ESKAPE病原菌快速检测方法，所述ESKAPE病原菌快速检测方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，进行扩增。反应体系包含一对用于扩增ESKAPR病原菌基因的特异性引物；
[0012]步骤二，进行cas12a反应。反应体系包含CRISPR
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Cas12a反应的crRNA和ssDNA荧光报告探针/试纸条探针，Cas12a蛋白核酸酶活性激活后，切割ssDNA荧光报告探针/试纸条探针，形成荧光基团
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ssDNA淬灭基团
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ssDNA/6
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FAM
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ssDNA和生物素
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ssDNA；
[0013]步骤三，进行荧光/试纸条检测。用于荧光检测时，针对含有荧光基团
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ssDNA的反应体系，在紫外光照射下发光；用于试纸条检测时，质控线T线的链酶亲和素结合生物素
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ssDNA，检测线负载的抗IgG结合抗FAM抗体与6
’‑
FAM
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ssDNA的复合物，而使检测线显色。
[0014]进一步，所述ESKAPE病原菌快速检测方法还包括ESKAPE病原菌种属特异性基因分析。
[0015]进一步，铜绿假单胞菌特异性序列为SEQ ID NO：1，鲍曼不动杆菌特异性序列为SEQ ID NO：2。
[0016]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的ESKAPE病原菌快速检测方法的ESKAPE病原菌快速检测系统，所述ESKAPE病原菌快速检测系统包括：
[0017]扩增模块，用于进行扩增；
[0018]cas12a反应模块，用于进行cas12a反应；
[0019]检测模块，用于进行荧光/试纸条检测。
[0020]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的ESKAPE病原菌快速检测方法在ESKPAE快速检测的试剂制备中的应用。
[0021]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的ESKAPE病原菌快速检测方法在用于ESKPAE病原菌早期诊断试纸条制备中的应用。
[0022]本专利技术的另一目的在于提供一种所述的ESKAPE病原菌快速检测方法在用于ESKPAE病原菌早期诊断试剂盒制备中的应用。
[0023]本专利技术的另一目的在于提供一种计算机设备，所述计算机设备包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述计算机程序被所述处理器执行时，使得所述处理器执行所述的ESKAPE病原菌快速检测方法。
[0024]本专利技术的另一目的在于提供一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，使得所述处理器执行所述的ESKAPE病原菌快速检测方法。
[0025]本专利技术的另一目的在于提供一种信息数据处理终端，所述信息数据处理终端用于实现所述的ESKAPE病原菌快速检测系统。
[0026]结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术提供的ESKAPE病原菌快速检测方法，1小时内即可完成，检测成本为100～150元，不需要依赖机器或仅需紫外灯，检测灵敏度高，对技术要求较小，能够实现POCT检测，具有广泛推广的价值。
[0027]本专利技术中16S rRNA基因可以作为CRISPR检测靶标；PCR联合CRISPR检测，实现细菌快速鉴定，敏感度与靶标有关；CRISPR检测联合荧光检测，精确定量鉴别；RPA扩增联合CRISPR检测，实现快速鉴定，且仪器要求低；RPA扩增联合CRISPR检测，灵敏度可以达到101CFU/m；混合体系的快速检测可以实现混合体系中的单菌检测，并且不影响检测灵敏度；试纸条法灵敏度达到103CFU/ml，完全不依赖仪器，实现POCT。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对本专利技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029]图1是本专利技术实施例提供的ESKAPE病原菌快速检测方法流程图。
[0030]图2是本专利技术实施例提供的ESKAPE病原菌快速检测方法原理图。
[0031]图3是本专利技术实施例提供的ESKAPE病原菌快速检测系统结构框图。
[0032]图4是本专利技术实施例提供的PCR联合CRISPR技术的检测结果示意图。
[0033]图5是本专利技术实施例提供的PCR联合CRISPR技术的检测精确度示意图。
[0034]图6是本专利技术实施例提供的RPA联合CRISPR技术的检测结果示意图。
[0035]图7是本专利技术实施例提供的RPA扩增联合CRISPR检测的灵敏度示意图。
[0036]图8是本专利技术实施例提供的混合体系的检测结果示意图。
[0037]图9是本专利技术实施例提供的试纸条法的检测结果示意图。
[0038]图10是本专利技术实施例提供的成果转化方式示意图。图11是本专利技术实施例提供的ESKAPE病原菌种属特异性基因分析示意图。
具体实施方式
[0039]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ESKAPE病原菌快速检测方法，其特征在于，所述ESKAPE病原菌快速检测方法包括以下步骤：步骤一，进行扩增。反应体系包含一对用于扩增ESKAPR病原菌基因的特异性引物；步骤二，进行cas12a反应。反应体系包含CRISPR
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Cas12a反应的crRNA和ssDNA荧光报告探针/试纸条探针，Cas12a蛋白核酸酶活性激活后，切割ssDNA荧光报告探针/试纸条探针，形成荧光基团
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ssDNA淬灭基团
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ssDNA/6
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FAM
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ssDNA和生物素
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ssDNA；步骤三，进行荧光/试纸条检测。用于荧光检测时，针对含有荧光基团
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ssDNA的反应体系，在紫外光照射下发光；用于试纸条检测时，质控线T线的链酶亲和素结合生物素
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ssDNA，检测线负载的抗IgG结合抗FAM抗体与6
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FAM
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ssDNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄广涛，黄斯旖，吴军，魏在荣，王达利，汪显峰，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：