含结核变态反应原EH的药物组合物及其用途制造技术

本公开提供了一种含结核变态反应原的融合蛋白EH或包含所述融合蛋白EH的药物组合物在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的用途，所述融合蛋白EH包含ESAT6和HspX。本公开提供的重组变态反应原EH，既有良好的特异性，又具备很高的灵敏度，可以适应于大规模筛查，是具有应用和开发潜力的新一代LTBI筛查和诊断的新型产品技术。本公开提供的重组变态反应原EH与EC相比具有更低的毒性，从而更安全。从而更安全。

【技术实现步骤摘要】
含结核变态反应原EH的药物组合物及其用途


[0001]本公开涉及医学检测
，具体涉及一种含结核变态反应原EH的药物组合物及其用途。

技术介绍

[0002]根据世界卫生组织(WHO)估算，当前全球约有17亿人感染了结核分枝杆菌，约占全球总人口的23％。在感染了结核分枝杆菌的潜伏性结核感染(Latent TB Infection，LTBI)的患者中，约有10％
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15％的人在一生中的某个时候会发展为结核病，对于结核潜伏感染人群的筛查与预防是结核病防治的重要手段，也是世界卫生组织“终结结核病流行策略”的重要组成部分。
[0003]目前，对结核潜伏感染者(LTBI)筛查主要有γ
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干扰素释放试验(IGRA)或结核菌素皮试(TST)两类方法。由于IGRA操作复杂，价格昂贵，不适合大规模人群筛查和贫困地区使用，而传统的TST，特异性低，不能区别卡介苗接种与结核杆菌感染，因此需要引入新的、特异性强、操作简便的筛查方法，甄别人群中的结核分枝杆菌感染者。
[0004]根据世界卫生组织《2020全球结核病报告》，目前全球应用重组变态反应原的皮肤检测试剂，主要包括DST(Diaskintest,Generium，俄罗斯)，C
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Tb(丹麦血清研究所)，EC(安徽智飞龙科马生物制药公司)，这三种检测方法，均为基于结核分枝杆菌早期分泌蛋白(ESAT6)和结核分枝杆菌培养过滤蛋白(CFP10)为抗原开发的皮肤试验方法，由于ESAT6和CFP10这2个蛋白在卡介苗和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失，因此这三个方法都比传统PPD(蛋白纯化衍生物)方法的特异性更好。
[0005]表1国产与进口检测LTBI方法变态反应原的比较
[0006]特点ECC
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TbDST抗原1ESAT6ESAT6CFP10抗原2CFP10CFP10ESAT6抗原制备方式融合蛋白抗原1:1混合融合蛋白与PPD蛋白量比较10倍等量2倍灵敏度83
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86％70％84％特异性>95％>95％>95％
[0007]对表1中3种试剂的变态反应原进行比较可以看出，3种方法选择的抗原蛋白相同，均为ESAT6和CFP10，这些产品在检测的灵敏度上相近(70
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86％)，按照文献报告，三种产品中，EC产品的灵敏度最高能达到86％，其蛋白组份的含量较高，相当于传统PPD产品含量的10倍。通常情况下，变态反应原含量越高，越容易引发机体的超敏反应，从而易于在安全性方面带来隐患，特别是CFP10，有报道显示，在大剂量应用于豚鼠实验时，可以引起豚鼠的结核菌素休克，而降低产品的蛋白含量会导致其灵敏度显著降低(在三个产品中，C
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Tb的蛋白含量最少，其灵敏度也最低，只能达到70％)。因此可以看出CFP10作为变态反应原并非最佳选择。
[0008]在2005年Reece等用纯化的CFP
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10进行豚鼠实验发现，高纯度的CFP10(可以排除是由杂质引起的)可以引起豚鼠的结核菌素休克(Reece ST,et al.Skin test performed with highly purified Mycobacterium tuberculosis recombinant protein triggers tuberculin shock in infected guinea pigs.Infection and Immunity.2005Jun；73(6):3301
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3306.)，在文章中作者用高度纯化的CFP
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10(10微克)对豚鼠进行DTH实验，同时用Mtb39作为对照，结果发现6
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36小时之内，50％的豚鼠死亡并且伴随结核菌素休克的症状，但是对照蛋白没有发生以上情况。虽然测试的CFP10的用量高于在EC产品中的CFP10的用量，但是对于已经感染结核的受试者或者体质敏感的测试者，很容易在低剂量的情况下发生过敏反应。结合其他研究者发表的关于CFP10可刺激TNF
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alpha的产生的研究(Trajkovic V,et al.Effect of Mycobacterium tuberculosis
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specific10
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kilodalton antigen on macrophage release of tumor necrosis factor alpha and nitric oxide.Infect Immun.2002Dec；70(12):6558
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66)，也提示对于CFP10作为抗原蛋白存在安全性的隐患。
[0009]结核分枝杆菌与卡介苗基因组相比存在一个卡介苗缺失的区域，即RD区。其他非RD区的基因，虽然与BCG存在交叉，但根据相关研究，通过控制剂量，也可以达到鉴别卡介苗免疫与结核感染的目的。Rv2031c编码的蛋白HspX(16KD蛋白)是一个研究与应用十分广泛的结核检测抗原。BCG只有在缺氧条件下表达小量Rv2031c(HspX)。Rv2031c(HspX)在NTM(非结核分枝杆菌)菌株中均不表达。2014年，Silva报道了利用HspX抗原检测类风湿病人中潜在的LTBI病人。这对于控制类风湿病人在感染结核杆菌后容易转化为活动性的结核病人非常重要。2017年，Castro
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Garza报道LTBI病人中的HspX的抗体要远远高于健康人和活动性结核病人，因此，HspX蛋白也被定为是潜伏感染的特异性蛋白。

技术实现思路

[0010]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种毒性小、安全性高的结核变态反应原EH或包含其的药物组合物，从而为结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查以及结核感染与卡介苗免疫的鉴别诊断等开辟一条新的途径。
[0011]在一方面，本公开提供了一种含结核变态反应原的融合蛋白EH或包含所述融合蛋白EH的药物组合物在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的用途。
[0012]在另一方面，本专利技术还提供了一种含结核变态反应原的融合蛋白EH或包含所述融合蛋白EH的药物组合物在制备用于鉴别诊断结核感染与卡介苗免疫的试剂或试剂盒中的用途。
[0013]本公开还提供一种上述融合蛋白或药物组合物的制备方法，具体步骤为：
[0014](1)构建表达融合蛋白的重组表达载体，其中所述融合蛋白包含ESAT6和HspX；
[0015](2)将所述重组表达载体转入宿主细胞培养，得到融合蛋白。
[0016]本公开应用自主筛选的重组变态反应原EH，选择在卡介苗和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失的ESAT6和在环境分枝杆菌中缺失、在卡介苗中只有在缺氧条件下才小量表达的HspX构建融合蛋白作为新型变态反应原。重组变态反应原EH既有良好的特异性，又具备很高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含结核变态反应原的融合蛋白EH或包含所述融合蛋白EH的药物组合物在制备用于结核病免疫学诊断、结核病辅助诊断或结核菌潜伏感染筛查的试剂或试剂盒中的用途；优选地，所述结核病免疫学诊断包括皮肤诊断、细胞因子释放试验或血清学诊断；优选地，所述结核菌潜伏感染筛查包括皮试实验；优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。2.一种含结核变态反应原的融合蛋白EH或包含所述融合蛋白EH的药物组合物在制备用于鉴别诊断结核感染与卡介苗免疫的试剂或试剂盒中的用途；优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。3.权利要求1或2所述的用途，其中，所述融合蛋白EH包含ESAT6和HspX；优选地，所述融合蛋白EH从N端至C端依次包含ESAT6和HspX；优选地，所述融合蛋白EH从N端至C端依次包含HspX和ESAT6；优选地，所述ESAT6和HspX之间包含接头。4.权利要求1
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3任一项所述的用途，其中所述ESAT6的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述ESAT6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述HspX的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述HspX的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；优选地，所述接头是柔性多肽；优选地，所述柔性多肽由柔性氨基酸组成，优选地，所述柔性多肽由2
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20个柔性氨基酸组成，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala和Thr中的至少一种；优选地，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；优选地，所述融合蛋白EH的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；更优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。5.权利要求1
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4任一项所述的用途，其中，所述ESAT6的编码核酸包含与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；更优选地，所述ESAT6的编码核酸如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述HspX的编码核酸包含与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭守杰，赵雁林，刘二勇，
申请(专利权)人：安博智联北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：