一种信号肽及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种信号肽及其编码基因与应用。该信号肽其氨基酸序列为序列表中序列１。本发明专利技术还公开了编码所述多肽的ＤＮＡ分子。所述ＤＮＡ分子的核苷酸序列为序列表中序列２。所述多肽和所述ＤＮＡ分子可在生产蛋白中的应用。本发明专利技术还公开了一种生产蛋白的方法，是将所述ＤＮＡ分子与目的基因融合获得融合基因，将所述融合基因导入酵母中，获得重组酵母，发酵所述重组酵母生产目的蛋白。本发明专利技术的α－交配因子的ｐｒｅ肽及其编码基因可用于生产Ｎ端有特殊结构的蛋白，蛋白产量高，纯化过程简单，且具有良好的生物活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种信号肽及其编码基因与应用。
技术介绍
由于核糖核酸酶抑制剂的存在，细胞中的核糖核酸酶降解RNA的水平不会影响 细胞的生存；然而，近年来越来越多具有细胞毒性的核糖核酸酶被发现，包括 ^^roge"i'/2、牛精液核糖核酸酶等。0nconase (以下简称0NC)，中文译名为豹蛙酶，最早分离自yfe朋w'/^'e/7S (北 极豹蛙)的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族(RNase A) 。 1988年 Mikiilski等发现纯化的蛋白质(p-30)及其粗提物(Pannon)体外能有效地抑制人 白血病细胞株HL-60、人下颚癌细胞株A-253和人腺癌细胞株ColQ 320 CM等的生 长及杀死这些细胞，并显示出时间-剂量依赖效应，同时体内试验进一步证明了其 抗肿瘤活性。1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据McoJ^y和r仂o加"esse 将其命名为0nconase。 1994年Merlino等用1. 7AX射线对其三维结构做了准确的 描述。1999年Eugenio等成功地在大肠杆菌系统中表达并纯化了 0NC重组蛋白，其 结构和性质类似于天然蛋白质。从1996到2004年Alfacell公司相继开展了 0NC 对乳腺癌、胰腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤等临床研究，其中对恶性间 皮瘤疗效显著，且副作用小。2003年开始0NC与阿霉素共同治疗恶性间皮瘤的III期 临床研究。0NC在细胞内具有良好的稳定性，药物体内半衰期为3h，溶解温度(Tra)值为 90°C，与核糖核酸酶抑制剂结合抑制常数(Ki)值约为1X10—6，是细胞毒性的重要 原因。作为RNase A家族的最小成员，0NC由104个氨基酸构成，含有一个N糖基 化位点(-N69-V70-T71-)，天然的0NC是非糖基化形式的。分子内4对半胱氨酸 形成的4个二硫键构成其基本骨架。C-末端cys87和cysl04形成的二硫键和N-端 谷氨酰氨环化构成了与RNase A结构的主要不同点(Arnold U等， ^'oc力e则's^r, 45:3580-7)。在氢键等弱相互作用下，分子内部形成7个P-折叠， 4个a螺旋和4个e -转角，其中有1个正平行三p -折叠和1个反平行三P -折叠。ONC及其前身北极豹蛙卵粗提物PannonTM，都是由Alfacell公司开发，并拥有 有关0NC商标和专利权，其中包括10项美国专利、4项欧洲专利和1项日本专利。 临床上使用的ONC是从豹蛙卵中提取的，步骤包括体内受精，排卵，提取卵母细胞，阴离子交换色谱，阳离子交换色谱和体积排阻色谱。该方法既费时又费力，代 价高得率低。利用基因工程手段在大肠杆菌中表达的0NC其N端第一个氨基酸均为 Met，且ONC全部以包涵体形式分泌到胞外，为了获得有活性的ONC，必须去除Met 和对包涵体进行变性和复性。巴斯德毕赤酵母(A'c力ia pa^ori's)是一种单细胞低等真核生物，被广泛地 应用于表达各种种属来源的外源蛋白，它是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表 达系统之一，利用巴斯德毕赤酵母表达系统已经成功表达了近700种外源蛋白。毕 赤酵母具有许多其它基因表达系统所不具备的优点具有强有力的醇氧化酶(A0XI )或磷酸苷油酸脱氢酶(GAP)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。作为 真核表达系统，可对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰等，从而使表达出 的蛋白质具有生物活性。生长繁殖速度快、营养要求低、培养基廉价，与高等真核 细胞相比，巴斯德毕赤酵母易于操作和培养。高稳定性。外源基因能通过质粒整合 到毕赤酵母的基因组上，这样得到的基因工程菌株比较稳定，不会出现外源基因随生长繁殖而丢失的现象。高生物量。工程菌株可进行高密度发酵培养，并能耐受较 高流体净压，在发酵罐中细胞干重可达120g/L以上。表达量高，许多外源蛋白在毕赤酵母中的表达可达到每升克级水平以上，例如巴西三叶胶羟腈裂解酶的表达量 可以达到22g/L。在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外，而 且毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，有利于纯化。糖基化程度低，免疫原性较低， 因此特别适合于生产医药用重组蛋白质。在真核细胞中，分泌性蛋白质在合成完成后，或者出胞或者在细胞内积累。一 般而言，决定蛋白质分泌和转运的是蛋白质N-端一段额外氨基酸序列，即信号肽或 信号序列。目前研究认为，外源蛋白质自细胞中高效地分泌过程中最重要的因素之 一是选择适宜的信号肽序列。 一般而言，外源信号序列虽可以引导蛋白质的分泌， 但效率一般较低。因此，在一定程度上，需要依赖酵母本身的分泌信号肽来指导外 源基因表达产物的分泌。常用的酵母信号肽有酸性磷酸酯酶(PH05)，蔗糖酶(SUC2)， Killer毒素和a-交配因子(MFa)等内源性信号肽，其中ct-交配因子分泌信号 在酵母表达系统中应用最广泛，其组成为pre+pro+(EAEA)H。外源基因融合于a-交配因子分泌信号，外源蛋白在胞质翻译完成后，a-交配因子分泌信号引导其进 入内质网腔，蛋白重新折叠成为正确的构象。Pre肽在内质网内被切除，Pro肽引 导外源蛋白进入高尔基体，反面膜的Kex2蛋白识别Pro肽C端的KR双碱性残基位 点并切割、释放外源蛋白，经胞吐作用分泌到胞外。但a-交配因子分泌信号也存 在不足之处。对于一些N端有特殊结构的蛋白质来说，使用a-交配因子往往导致 目的蛋白表达量低或表达产物没有活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种信号肽及其编码基因与应用。本专利技术所提供的信号肽，是a-交配因子的pre肽，其氨基酸序列为序列表中 序列1 。编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子也属于本专利技术的保护范围。 所述DNA分子的核苷酸序列具体可为序列表中序列2。外源基因与分泌信号融合，外源蛋白在胞质翻译完成后，分泌信号引导其进入 内质网腔，蛋白重新折叠成为正确的构象。但是， 一些N端有特殊结构的蛋白(如 0nconase)不适合用酵母本身的a -交配因子(不论是否含有EAEA结构)作为分泌 信号。本专利技术的a-交配因子的pre肽作为分泌信号则可以引导N端有特殊结构的蛋 白(如0nconase)。可将编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子与目的基因融 合获得融合基因，将融合基因导入宿主细胞中，表达目的蛋白并分泌到细胞外。所述的融合基因也属于本专利技术的保护范围。该融合基因是所述DM分子与目的基因融合获得的函A分子。如为了生产 0nconase，编码所述a -交配因子的pre肽的DNA分子与0nconase基因融合，获得 的融合基因的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3或序列5。含有所述DNA分子、所述融合基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌， 扩增所述DNA分子或所述融合基因的全长及其任意片段的引物对也属于本专利技术的保 护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种生产蛋白的方法。本专利技术所提供的生产蛋白的方法，是将所述融合基因导入酵母中，获得重组酵 母，发酵所述重组酵母生产目的蛋白。本专利技术的a-交配因子的pre肽可以引导N端有特殊结构的蛋白(如Onconase)自细胞中高效地分泌，糖基化Onconase和非糖基化的0nconase的表达量达到 300本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其氨基酸序列为序列表中序列１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志敏，何庆，赵洪亮，薛冲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]