安全港基因座制造技术

本文提供了安全港基因座以及用于鉴定和使用安全港基因座的方法。所述安全港基因座表现出提高的敲入效率，并允许增加的稳定转基因表达。表达。表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】安全港基因座
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2021年4月23日提交的美国临时专利申请第63/179,143号、2021年1月26日提交的美国临时专利申请第63/141,926号和2020年10月26日提交的美国临时专利申请第63/105,834号的优先权和权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有将通过EFS网提交并且据此以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ASCII副本于2021年10月15日创建，名为ANB
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203WO_SequenceListing并且大小是623,177字节。

技术介绍

[0005]尽管在癌症治疗方面进行了大量的研究工作并且取得了科学进步，但癌症仍然是一个重大的临床负担。血液和骨髓癌症是常被诊断出的癌症类型，包括多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。目前针对这些癌症的治疗选择并非对所有患者都有效，并且/或者可能有显著的不良副作用。使用现有的治疗选择来治疗其他类型的癌症也仍然具有挑战性。癌症免疫疗法是一种很有前途的解决方案，因为它们具有高度特异性，可以提高治疗效果并减轻副作用。
[0006]基因工程化免疫细胞疗法是一个不断发展的领域，在治疗包括但不限于癌症在内的疾病方面具有广阔的应用前景。通过改变编码和/或非编码基因组区域，研究人员正在鉴定细胞内有助于例如增强细胞功能、阻止细胞生长、诱导细胞死亡和肿瘤大小/体积缩小的转基因和插入位点。安全港位点(SHS)的鉴定提高了基因组工程化疗法的结果。众所周知的SHS包括19号染色体上的AAVS1腺相关病毒插入位点、鼠Rosa26基因座的人同系物，以及CCR5趋化因子受体基因，这些基因的缺失赋予HIV抗性。(参见，例如，Pellenz等人,2018，其相关公开内容以引用的方式并入本文)。然而，仍然需要用于基因编辑疗法和额外的SHS的改进的指南，以解决诸如低敲入(KI)效率、插入性肿瘤发生、转基因和/或相邻基因的不稳定和/或异常表达等挑战。

技术实现思路

[0007]本公开尤其针对表现出高敲入效率和其转基因的稳定表达的安全港基因座。这些安全港基因座可用于改变T细胞以用于免疫疗法。这些安全港基因座可用于治疗包括癌症在内的各种疾病。
[0008]在一方面，本公开提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含至少一个编码转基因的序列，其中所述至少一个序列插入安全港基因座内，所述安全港基因座处于表4中提供的sgRNA靶基因座中的任一者或多者处；并且其中所述至少一个编码所述转基因的序列的表达可操作地连接至内源启动子。在另一方面，本公开提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含至少一个编码转基因的序列，其中所述至少一个序列插入安全港基因座内，所述安全港基因座处于表4中提供的sgRNA靶基因座中的任一者或多者处；并且其中所述至少
一个编码所述转基因的序列的表达可操作地连接至外源启动子。
[0009]在一些实施方案中，所述靶基因座选自：chr10:33130000
‑
33140000、chr10:72290000
‑
72300000、chr11:128340000
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128350000、chr11:65425000
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65427000(NEAT1)、chr15:92830000
‑
92840000、chr16:11220000
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11230000、chr2:87460000
‑
87470000、chr3:186510000
‑
186520000、chr3:59450000
‑
59460000、chr8:127980000
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128000000和chr9:7970000
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7980000。在一些实施方案中，所述靶基因座选自：chr10:72290000
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72300000、chr11:128340000
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128350000、chr15:92830000
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92840000和chr16:11220000
‑
11230000。在一些实施方案中，所述靶基因座是chr11:128340000
‑
128350000。在一些实施方案中，所述靶基因座是chr15:92830000
‑
92840000。在一些实施方案中，所述靶基因座是选自以下的基因：APRT、B2M、CAPNS1、CBLB、CD2、CD3E、CD3G、CD5、EDF1、FTL、PTEN、PTPN2、PTPN6、PTPRC、PTPRCAP、RPS23、RTRAF、SERF2、SLC38A1、SMAD2、SOCS1、SRP14、SRSF9、SUB1、TET2、TIGIT、TRAC和TRIM28。
[0010]在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS88、GS89、GS90、GS91、GS92、GS93、GS94、GS95、GS96、GS97、GS98、GS99、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104、GS105、GS106、GS107、GS108、GS109、GS110、GS111、GS112、GS113、GS114、GS115、GS116、GS117、GS118、GS119或GS120。在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS91、GS92、GS93、GS94、GS95、GS96、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104和GS105。在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS103、GS104和GS105。在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS95和GS96。在一些实施方案中，所述安全港基因座是表4中的GS94整合位点。在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS100、GS101和GS102。在一些实施方案中，所述安全港基因座是表4中的GS102整合位点。在一些实施方案中，所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS91、GS92和GS93。
[0011]在一些实施方案中，所述外源启动子是EF1a启动子。在一些实施方案中，所述工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述转基因编码重组蛋白，任选地治疗剂。在一些实施方案中，所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。
[0012]在另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含如本文所述的工程化细胞和药物赋形剂。
[0013]在另一方面，本公开提供了一种用于在安全港基因座处编辑细胞的指导核糖核酸(gRNA)，其中gRNA包含表4中的sgRNA序列中的任本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含至少一个编码转基因的序列，其中所述至少一个序列插入安全港基因座内，所述安全港基因座处于表4中提供的sgRNA靶基因座中的任一者或多者处；并且其中所述至少一个编码所述转基因的序列的表达可操作地连接至内源启动子。2.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含至少一个编码转基因的序列，其中所述至少一个序列插入安全港基因座内，所述安全港基因座处于表4中提供的sgRNA靶基因座中的任一者或多者处；并且其中所述至少一个编码所述转基因的序列的表达可操作地连接至外源启动子。3.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
‑
128350000、chr10:33130000
‑
33140000、chr10:72290000
‑
72300000、chr11:65425000
‑
65427000(NEAT1)、chr15:92830000
‑
92840000、chr16:11220000
‑
11230000、chr2:87460000
‑
87470000、chr3:186510000
‑
186520000、chr3:59450000
‑
59460000、chr8:127980000
‑
128000000或chr9:7970000
‑
7980000。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的工程化细胞，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
‑
128350000、chr10:72290000
‑
72300000、chr15:92830000
‑
92840000或chr16:11220000
‑
11230000。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的工程化细胞，其中所述sgRNA靶基因座是chr11:128340000
‑
128350000。6.如权利要求1
‑
4中任一项所述的工程化细胞，其中所述sgRNA靶基因座是chr15:92830000
‑
92840000。7.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述sgRNA靶基因座是选自以下的基因：APRT、B2M、CAPNS1、CBLB、CD2、CD3E、CD3G、CD5、EDF1、FTL、PTEN、PTPN2、PTPN6、PTPRC、PTPRCAP、RPS23、RTRAF、SERF2、SLC38A1、SMAD2、SOCS1、SRP14、SRSF9、SUB1、TET2、TIGIT、TRAC或TRIM28。8.如权利要求1
‑
3中任一项所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS88、GS89、GS90、GS91、GS92、GS93、GS95、GS96、GS97、GS98、GS99、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104、GS105、GS106、GS107、GS108、GS109、GS110、GS111、GS112、GS113、GS114、GS115、GS116、GS117、GS118、GS119或GS120。9.如权利要求1
‑
4中任一项所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS91、GS92、GS93、GS95、GS96、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104和GS105。10.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS103、GS104或GS105。11.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS95或GS96。12.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座是表4中的GS94整合位点。13.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS100、GS101或GS102。
14.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座是表4中的GS102整合位点。15.如权利要求8或9所述的工程化细胞，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS91、GS92或GS93。16.如权利要求2
‑
15中任一项所述的工程化细胞，其中所述外源启动子是EF1a启动子。17.如权利要求1
‑
16中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。18.如权利要求17所述的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞或T细胞祖细胞。19.如权利要求1
‑
18中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是未分化的。20.如权利要求1
‑
18中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为CD45RA
+
和CCR7
+
。21.如权利要求1
‑
20中任一项所述的工程化细胞，其中所述转基因编码重组蛋白，任选地治疗剂。22.如权利要求1
‑
21中任一项所述的工程化细胞，其中所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。23.一种组合物，所述组合物包含权利要求1
‑
22中任一项所述的工程化细胞和药物赋形剂。24.一种用于在安全港基因座处编辑细胞的指导核糖核酸(gRNA)，其中gRNA包含表4中的sgRNA序列中的任一者。25.如权利要求24所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ IDNO:1
‑
120中的任一者。26.如权利要求24或25所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:91
‑
96和100
‑
105中的任一者。27.如权利要求24
‑
26中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:102。28.如权利要求24
‑
26中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94。29.如权利要求24
‑
26中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:102。30.如权利要求24
‑
29中任一项所述的gRNA，其中所述细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。31.一种编辑具有染色体DNA的细胞的方法，所述方法包括在所述细胞的所述染色体DNA中的安全港基因座内插入至少一个编码转基因的序列，其中所述安全港基因座是表4中提供的sgRNA靶基因座中的任一者或多者。32.如权利要求31所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
‑
128350000、chr10:33130000
‑
33140000、chr10:72290000
‑
72300000、chr11:65425000
‑
65427000(NEAT1)、chr15:92830000
‑
92840000、chr16:11220000
‑
11230000、chr2:87460000
‑
87470000、chr3:186510000
‑
186520000、chr3:59450000
‑
59460000、chr8:127980000
‑
128000000或chr9:7970000
‑
7980000。33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
‑
128350000、chr10:72290000
‑
72300000、chr15:92830000
‑
92840000或chr16:11220000
‑
11230000。
34.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是chr11:128340000
‑
128350000。35.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是chr15:92830000
‑
92840000。36.如权利要求31所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是选自以下的基因：APRT、B2M、CAPNS1、CBLB、CD2、CD3E、CD3G、CD5、EDF1、FTL、PTEN、PTPN2、PTPN6、PTPRC、PTPRCAP、RPS23、RTRAF、SERF2、SLC38A1、SMAD2、SOCS1、SRP14、SRSF9、SUB1、TET2、TIGIT、TRAC或TRIM28。37.如权利要求31或32所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS88、GS89、GS90、GS91、GS92、GS93、GS95、GS96、GS97、GS98、GS99、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104、GS105、GS106、GS107、GS108、GS109、GS110、GS111、GS112、GS113、GS114、GS115、GS116、GS117、GS118、GS119或GS120。38.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS91、GS92、GS93、GS95、GS96、GS100、GS101、GS102、GS103、GS104或GS105。39.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS103、GS104或GS105。40.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS94、GS95或GS96。41.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是表4中的GS94整合位点。42.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS100、GS101或GS102。43.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是表4中的GS102整合位点。44.如权利要求31
‑
33中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座选自表4中标示的整合位点中的任一者：GS91、GS92或GS93。45.如权利要求31
‑
44中任一项所述的方法，其中所述转基因编码重组蛋白，任选地治疗剂。46.如权利要求31
‑
45中任一项所述的方法，其中所述转基因编码嵌合抗原受体(CAR)。47.如权利要求31
‑
46中任一项所述的方法，其中所述至少一个序列包含外源启动子并且所述外源启动子可操作地连接至所述转基因。48.如权利要求47所述的方法，其中所述外源启动子是EF1a启动子。49.如权利要求31
‑
48中任一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。50.如权利要求49所述的方法，其中所述细胞是T细胞或T细胞祖细胞。51.如权利要求31
‑
50中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞是未分化的。52.如权利要求31
‑
51中任一项所述的方法，其中所述工程化细胞为CD45RA
+
和CCR7
+
。53.如权利要求31
‑
52中任一项所述的方法，其中使用同源定向修复来插入所述至少一个序列。
54.如权利要求31
‑
52中任一项所述的方法，其中使用同源非依赖性靶向插入来插入所述至少一个序列。55.如权利要求31
‑
54中任一项所述的方法，其中使用一个或多个指导核糖核酸(gRNA)和一个或多个Cas9核酸内切酶来插入所述至少一个序列。56.如权利要求55所述的方法，其中所述一个或多个gRNA包含SEQ ID NO:1
‑
120中的任一者。57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述一个或多个gRNA包含SEQ ID NO:91
‑
96和100
‑
105中的任一者。58.如权利要求55
‑
57中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:102。59.如权利要求55
‑
58中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94。60.如权利要求55
‑
58中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:102。61.一种编辑T细胞的方法，所述方法包括使T细胞与一个或多个指导核糖核酸(gRNA)、至少一个编码转基因的序列和一个或多个Cas9核酸内切酶接触，其中所述一个或多个gRNA和Cas9核酸内切酶促进将所述至少一个序列插入安全港基因座内的染色体DNA中，其中所述安全港基因座选自表4中的sgRNA靶基因座中的任一者或多者。62.如权利要求61所述的方法，其中所述一个或多个gRNA包含选自表4中的sgRNA序列中的任一者的序列。63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述一个或多个gRNA包含SEQ ID NO:1
‑
120中的任一者。64.如权利要求61
‑
63中任一项所述的方法，其中所述一个或多个gRNA包含SEQ ID NO:91
‑
96和100
‑
105中的任一者。65.如权利要求61
‑
64中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:102。66.如权利要求61
‑
65中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:94。67.如权利要求61
‑
65中任一项所述的方法，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:102。68.如权利要求61
‑
67中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
‑
128350000、chr10:33130000
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33140000、chr10:72290000
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72300000、chr11:65425000
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65427000(NEAT1)、chr15:92830000
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92840000、chr16:11220000
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11230000、chr2:87460000
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87470000、chr3:186510000
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186520000、chr3:59450000
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59460000、chr8:127980000
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128000000或chr9:7970000
‑
7980000。69.如权利要求61
‑
68中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座选自：chr11:128340000
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128350000、chr10:72290000
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72300000、chr15:92830000
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92840000或chr16:11220000
‑
11230000。70.如权利要求61
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69中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是chr11:128340000
‑
128350000。71.如权利要求61
‑
69中任一项所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是chr15:92830000
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92840000。72.如权利要求61
‑
67所述的方法，其中所述sgRNA靶基因座是选自以下的基因：APRT、
B2M、CAPNS1、CBLB、CD2、CD3E、CD3G、CD5、EDF1、FTL、PTEN、PTPN2、PTPN6、PTPRC、PTPRCAP、RPS23、RTRAF、SERF2、SLC38A1、SMAD2、SOCS1、SRP14、SR...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑新颍，B，
申请(专利权)人：阿森纳生物科学公司，
类型：发明
国别省市：