用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物制造技术

本发明专利技术涉及用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物


[0001]本专利技术属于禽病学领域，具体涉及一种用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物。

技术介绍

[0002]圆圈病毒Gyrovirus(GyVs)为单链环状DNA病毒，该病毒属过去只有一个成员，即鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)，2011年以来，研究人员陆续分离到9种与CIAV基因结构类似的病毒。圆圈病毒的宿主较广泛，宿主有鸡、人和野鸟，有的圆圈病毒既可感染鸡也可以感染人。该病毒属曾经属于圆环病毒科(Circoviridae)，由于圆圈病毒在结构上和遗传信息上均与细环病毒科(Anelloviridae)成员更加相似，因此2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类法，GyVs被重新分配到细环病毒科家族。圆圈病毒属可以分为三个分支，分别是包含CIAV、HGyV/AGV2、GyV3、GyV6、GyV7和GyV9的A分支；包含GyV4和GyV5的B分支；以及包含GyV8的C分支。圆圈病毒基因组约2.2～2.4kb，由5
’
端的非编码区和3个重叠的开放阅读框(ORF)组成。三个重叠的ORF分别编码结构蛋白VP1，骨架蛋白VP2以及凋亡蛋白VP3。
[0003]2011年，有研究者从健康法国成年人的皮肤表面分离到了人的GyVs(Human GyVs，HGyV)；同一年，从表现为精神沉郁、体重减轻的巴西某患病鸡群的血清中也分离到了一种GyVs，即鸡的GyVs2(Avian GyV2，AGV2)，该病毒与CIAV只有40％的同源性，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与CIAV相应蛋白的同源性分别为38.8％、40.3％和32.2％。2012年有研究人员在腹泻患者的粪便中检测到了HGyV，并且检出率为1
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9.3％。研究指出，HGyV与AGV2密切相关，HGyV和AGV2的VP1
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3蛋白质序列差异性仅为3
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7％，表明HGyV与AGV2属于同一种病毒。2012年有研究者首次从智利和中国香港急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定出人源GyV3。2018年我国学者首次从患有典型鸡传染性腺胃炎的病鸡腺胃中鉴定出GyV3。又有研究通过鸡和小鼠致病性试验证实：GyV3可引起鸡的传染性腺胃炎和贫血，并且可跨种感染小鼠，引起小鼠胃肠炎和贫血。GyV3的基因组约包含2356个碱基序列，与其他GyVs具有相似的基因组结构，其VP1和VP2蛋白与HGyV/AGV2相应蛋白的氨基酸序列的同源性分别为62％和63％，与其他的已知GyVs VP3氨基酸序列具有57％的相似性。最近，在被感染的鸡的体内检测到GyV7，基因组为2439bp，非编码区514bp，其VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸序列与GyV7相应蛋白的同源性最高分别为49％、53％和63％。
[0004]AGV2、GyV3和GyV7是近年来在鸡群中新发现的病毒，这3种病毒共感染的情况在鸡中比较常见。但是，当前尚未见可同时对3种新发鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7进行PCR检测的研究报道，本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。本专利技术建立的PCR检测方法能够同时对鸡群中流行的AGV2、GyV3和GyV7的进行检测，为鸡群中开展新发AGV2、GyV3和GyV7病毒的流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物，结合DNA测序可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别检测。
[0006]本专利技术的目的通过如下技术方案实现：
[0007]一种用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物，所述通用引物如下所示：
[0008]GyVs
‑
F：5
’‑
GGGCAGTGAATTGCCGYTTAG
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0009]GyVs
‑
R：5
’‑
CCGGGVCKTGGGTTGAAKA
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0010]其中，Y＝C/T，V＝G/A/C，K＝G/T。
[0011]所述的通用引物在制备同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7试剂盒中的应用。
[0012]一种用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的试剂盒，所述试剂盒包括所述的通用引物。
[0013]一种利用所述通用引物同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的检测方法，该方法不以诊断为目，其PCR反应体系为：在50μL体系中含有以下成分，其中2
×
Premix Taq PCR扩增反应液25μL、20μM上游引物GyVs
‑
F 1μL、20μM下游引物GyVs
‑
R 1μL、制备的DNA模板2μL、补充灭菌水至终体积50μL，混匀后进行PCR扩增；
[0014]PCR扩增条件为：94℃预变性3min后进入循环，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃延伸10min，反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0015]其PCR产物如下：AGV2：629bp；GyV3：653bp；GyV7：649bp；结合DNA测序同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7进行鉴别检测。
[0016]本专利技术设计得到的通用引物可同时特异性扩增出AGV2、GyV3和GyV7，因此可仅在只使用一对引物的基础上同时检测AGV2、GyV3和GyV7，不会出现因引物过多而存在交叉干扰的问题，而且该通用引物无法扩增出其他常见鸡传染病(产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒、J亚群禽白血病病毒等)，从而具有较好的特异性。
[0017]较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：本专利技术通过分析AGV2、GyV3和GyV7基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于同时检测AGV2、GyV3和GyV7的引物。该方法简便快速，可同时对AGV2、GyV3和GyV7进行检测；特异性强，对常见鸡传染病(产蛋下降综合征病毒、禽4型腺病毒、禽流感病毒H9、鸡新城疫病毒、J亚群禽白血病病毒等)均无交叉；优化程序简单(常规针对3个病原需设计6条引物，而本专利技术仅需设计2条引物，便于条件优化)；结合DNA测序可同时对鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7感染情况进行科学鉴别检测。本专利技术的建立可填补国内外相关领域空白。
附图说明
[0018]图1是本专利技术PCR方法的电泳结果图，其中，M：DNA分子量DL2000；1：AGV2；2：GyV3；3：GyV7；4：AGV2和GyV3共感染；5：AGV2和GyV7共感染；6：GyV3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的通用引物，其特征在于：所述通用引物如下所示：GyVs
‑
F：5
’‑
GGGCAGTGAATTGCCGYTTAG
‑3’
；GyVs
‑
R：5
’‑
CCGGGVCKTGGGTTGAAKA
‑3’
。2.如权利要求1所述的通用引物在制备同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7试剂盒中的应用。3.一种用于同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的通用引物。4.一种利用权利要求1所述的通用引物同时检测鸡圆圈病毒AGV2、GyV3和GyV7的检测方法，该方法不以诊断为目，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：林琳，江斌，吴胜会，蔡羲，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：