大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法技术方案

本发明专利技术提供一种大肠杆菌基因编辑系统，包含大肠杆菌、辅助质粒和供体质粒。其中辅助质粒包含转座酶复合物表达盒、Cas12k表达盒、第一sgRNA盒、第一抗生素抗性基因和第一复制起始点，供体质粒包含ShCAST转座子左端序列、外源基因表达盒、ShCAST转座子右端序列、第二sgRNA盒、第二抗生素抗性基因和一第二复制起始点。所述大肠杆菌基因编辑系统可以简便且有效的嵌入大片段的DNA序列至目标染色体中，且不会造成大肠杆菌基因组的双链断裂，以调节不同生物技术中有用的大肠杆菌菌株代谢途径。同生物技术中有用的大肠杆菌菌株代谢途径。同生物技术中有用的大肠杆菌菌株代谢途径。

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法


[0001]本专利技术是有关于一种微生物的基因编辑技术，特别是一种大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法。【先前技术】
[0002]大肠杆菌是工业上用于生产重组蛋白和生质(biomass)化学品的最广泛使用的细菌。有许多不同的大肠杆菌菌株用于各种目的。例如，BL21(DE3)菌株常用于重组蛋白生产；MG1655、W3110和W菌株用于生产生质化学品；DH10Bac菌株含有结合杆状病毒基因组和质粒特征的杆粒(Bacmid)，在Bac
‑
to
‑
Bac
TM
系统中被用于杆粒的改造，基改杆粒可用来生产重组杆状病毒，重组杆状病毒常用于生产重组蛋白或是当作基因递送的载体。
[0003]为了提高大肠杆菌的生产性能，通常需要嵌入多种代谢途径基因至目标染色体，来永久操纵代谢途径。然而将大片段基因嵌入到大肠杆菌中仍然是一项具有挑战性的任务。尽管使用λ
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Red系统的基因重组可以轻松地将基因嵌入到大肠杆菌中，但嵌入片段大小极有限。自从CRISPR/Cas9技术问世以来，CRISPR/Cas9与λ
‑
Red结合以进一步提高嵌入DNA大小，成功嵌入大于10kb的DNA片段到大肠杆菌基因组中。尽管CRISPR/Cas9结合λ
‑
Red系统可在MG1655菌株中进行基因工程与代谢工程，但在其他重要大肠杆菌菌株如BL21(DE3)和W中的基因嵌入效率相对较低，可能是因为前述系统诱导DNA双链断裂(double
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strand breaks,DSBs)，并利用内在的DNA修复机制，将欲嵌入的DNA嵌入到基因组中。然而不同菌株的DNA修复能力差异很大，因此导致其他大肠杆菌菌株的嵌入效率较低。
[0004]CRISPR相关转座酶(ShCAST)是一种新兴的靶向基因组敲入和敲除的强大工具，其无关于宿主细胞修复机制，结合了转座酶的高效DNA嵌入和CRISPR介导的可编程无DNA双链断裂的基因嵌入，但ShCAST技术在染色体特定位置仍有嵌入不佳的问题。因此，如何改善上述应用于大肠杆菌的基因编辑系统的缺失，为目前所欲解决的重要课题之一。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供一种大肠杆菌基因编辑系统及其基因编辑方法，所述大肠杆菌基因编辑系统透过增强Cas12k基因表达、修改复制起始点的序列以及增加sgRNA表达量，只需表达四种蛋白，由两个质粒协作即可进行多位点基因嵌入，并嵌入大片段DNA至目标染色体中。并可进一步降低基因编辑时的温度，以提升基因编辑效率。
[0006]本专利技术之一态样是在提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑系统，其包含大肠杆菌、辅助质粒和供体质粒。辅助质粒包含依序排列之转座酶复合物表达盒、Cas12k表达盒、第一sgRNA盒、第一抗生素抗性基因和第一复制起始点。其中转座酶复合物表达盒包含第一启动子、tnsB基因、tnsC基因和tniQ基因，Cas12k表达盒包含第二启动子和Cas12k基因，第一sgRNA盒包含第三启动子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和间隔(spacer)所构成。供体质粒包含依序排列之ShCAST转座子左端序列、外源基因表达盒、ShCAST转座子右端序列、第二sgRNA盒、第二抗生素抗性基因和第二复制起始点。外源基因表达盒包含外源基因，第二sgRNA盒包含一第四启动子和sgRNA序列。其中间隔之序列与大肠杆菌之染色体
之第一特定序列相对应，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。
[0007]依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中所述第二启动子可为lac启动子、Tet启动子、T7启动子、Tac启动子或J23118启动子。
[0008]依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中转座酶复合物表达盒可更包含一终止子，且终止子连接于tniQ基因之3
’
端。
[0009]依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中外源基因表达盒可更包含第五启动子和第三抗生素抗性基因，且所述第三抗生素抗性基因与第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。
[0010]依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中供体质粒可更包含CRISPRi模块(module)，所述CRISPRi模块位于ShCAST转座子左端序列和外源基因表达盒之间。
[0011]依据前述之大肠杆菌基因编辑系统，其中大肠杆菌可为BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。
[0012]本专利技术之另一态样是在提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑方法，包含下述步骤：先构建辅助质粒和供体质粒。其中辅助质粒包含依序排列之转座酶复合物表达盒、Cas12k表达盒、第一sgRNA盒、第一抗生素抗性基因和第一复制起始点，其中转座酶复合物表达盒包含第一启动子、tnsB基因、tnsC基因和tniQ基因，Cas12k表达盒包含第二启动子和Cas12k基因，第一sgRNA盒包含第三启动子和sgRNA序列。所述sgRNA序列由骨架和间隔(spacer)所构成。供体质粒包含依序排列之ShCAST转座子左端序列、外源基因表达盒、ShCAST转座子右端序列、第二sgRNA盒、第二抗生素抗性基因和第二复制起始点，其中外源基因表达盒包含外源基因，第二sgRNA盒包含第四启动子和sgRNA序列，且第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因不相同。将辅助质粒和供体质粒共同转化至大肠杆菌中，以得到转化株。再培养所述转化株，系于一编辑温度下培养一编辑时间，其中辅助质粒表达之一TnsB蛋白、一TnsC蛋白、一TniQ蛋白和一Cas12k蛋白形成一ShCAST转座子蛋白酶复合物，且辅助质粒表达sgRNA序列，供体质粒表达sgRNA序列，将外源基因嵌入转化株之第一特定序列中。
[0013]依据前述之大肠杆菌基因编辑方法，其中大肠杆菌可为BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。
[0014]依据前述之大肠杆菌基因编辑方法，其中所述编辑温度可为30℃。
[0015]依据前述之大肠杆菌基因编辑方法，其中供体质粒可更包含一CRISPRi模块，CRISPRi模块位于ShCAST转座子左端序列和外源基因表达盒之间。
[0016]依据前述之大肠杆菌基因编辑方法，可更包含一筛选步骤，系以含有抗生素之培养基培养转化株，以筛选成功共同转化辅助质粒和供体质粒的转化株。
[0017]依据前述之大肠杆菌基因编辑方法，其中抗生素可为氨苄青霉素(ampicillin,Amp)、卡纳霉素(kanamycin,Km)、壮观霉素(spectinomycin,Spc)或氯霉素(chloramphenicol,Cm)。【图式简单说明】
[0018]为让本专利技术之上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑系统，其特征在于，包含：一大肠杆菌；一辅助质粒，包含依序排列之一转座酶复合物表达盒、一Cas12k表达盒、一第一sgRNA盒、一第一抗生素抗性基因和一第一复制起始点，其中转座酶复合物表达盒包含一第一启动子、一tnsB基因、一tnsC基因和一tniQ基因，该Cas12k表达盒包含一第二启动子和一Cas12k基因，该第一sgRNA盒包含一第三启动子和一sgRNA序列，该sgRNA序列由一骨架和一间隔(spacer)所构成；以及一供体质粒，包含依序排列之一ShCAST转座子左端序列、一外源基因表达盒、一ShCAST转座子右端序列、一第二sgRNA盒、一第二抗生素抗性基因和一第二复制起始点，其中该外源基因表达盒包含一外源基因，该第二sgRNA盒包含一第四启动子和该sgRNA序列；其中该间隔之序列与该大肠杆菌之一染色体之一第一特定序列相对应，且该第一抗生素抗性基因和该第二抗生素抗性基因不相同。2.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该第二启动子为lac启动子、Tet启动子、T7启动子、Tac启动子或J23118启动子。3.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该转座酶复合物表达盒更包含一终止子，且该终止子连接于该tniQ基因之3
’
端。4.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该外源基因表达盒更包含一第五启动子和一第三抗生素抗性基因，且该第三抗生素抗性基因与该第一抗生素抗性基因和该第二抗生素抗性基因不相同。5.如权利要求4所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该供体质粒更包含一CRISPRi模块，该CRISPRi模块位于该ShCAST转座子左端序列和该外源基因表达盒之间。6.如权利要求1所述之大肠杆菌基因编辑系统，其特征在于，该大肠杆菌为BL21(DE3)菌株、BW25113菌株、MG1655菌株、W3110菌株、W菌株或DH10Bac菌株。7.一种大肠杆菌(Escherichia coli)基因编辑方法，其特征在于，包含：构建一辅助质粒，其中该辅助质粒包含依序排列之一转座酶复合物表达盒、一Cas12k表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡育诚，张晋维，黄靖雯，周俊彦，
申请(专利权)人：胡育诚，
类型：发明
国别省市：