一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株及其应用，该菌株为海洋沙雷氏菌J5，其分类命名为Serratia sp.，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO:M 20221678。本发明专利技术所生产的几丁质酶，可应用于食品、化妆品和医药领域，具有极大的应用推广价值。的应用推广价值。的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株及其应用


[0001]本专利技术为海洋微生物及其生物制品领域，具体的涉及到高盐海洋沙雷氏菌的筛选和培养，及其所产几丁质酶的性质分析。

技术介绍

[0002]浙江省宁波地区拥有“港、渔、景、岛、涂、油”等海洋资源，沿海滩涂、湿地广袤，海洋生物资源丰富，物种多样性十足。对海洋生物资源进行探索，获得具有应用潜力的酶制剂生产菌株，具有巨大的科研和商业开发前景。
[0003]沙雷氏菌广泛存在于自然界，为革兰氏阴性菌，菌体为球状或短杆状，无荚膜，身上有鞭毛，具有运动性，对温度敏感，在20
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28℃时可产生红色色素，温度继续升高产色素能力逐渐消失。根据已有文献报道沙雷氏菌能够生产一些特色酶制剂，比如作为原料药的舍雷肽酶。
[0004]几丁质是仅次于纤维素的第二大可再生的天然多糖，但几丁质废弃物不易降解，将富含几丁质的废弃物进行降解并将其转化为高附加值的产品是目前研究的一大热点。几丁质酶是一种可以水解几丁质的具有生物催化活性的水解酶，可以将几丁质水解成几丁寡糖或者N
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乙酰葡萄糖胺，这些产物在农业和食品领域具有重要的应用价值。几丁质酶在农业上主要是防治害虫，可以直接作为杀虫剂或者和其他微生物协同防治害虫，几丁质酶基因转入植物中，可以增强植物的抗病性。产几丁质酶的微生物种类有细菌、真菌、放线菌。海洋、河湾、土壤中分布大量几丁质酶产生菌，一些海滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌的理想场所。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上现有技术的缺点：提供一种pH稳定性、温度稳定性较好的海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株。
[0006]本专利技术的技术解决方案如下：一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株：该菌株为海洋沙雷氏菌J5，其分类命名为Serratia sp.，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO:M 20221678。
[0007]作为优选，所述沙雷氏菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1。
[0008]作为优选，所述沙雷氏菌是从浙江宁波沿海及滨海湿地水样及腐殖质中分离得到的。
[0009]作为优选，该菌株的筛选限制性培养基为天然海水配制的几丁质培养基(g/L)：几丁质粉末10.0，硫酸铵2.0，磷酸高铁0.1；摇瓶培养条件为：30℃，180rpm/min，恒温培养。
[0010]作为优选，用于表达几丁质酶，所述的几丁质酶可受到几丁质的诱导表达。
[0011]作为优选，所述几丁质酶的温度稳定性范围为4℃～50℃。
[0012]作为优选，所述几丁质酶的最适温度为50℃。
[0013]作为优选，所述几丁质酶的pH稳定性范围为3.0～7.0。
[0014]作为优选，所述几丁质酶的最适pH为6.0。
[0015]本专利技术的有益效果：本专利技术分离和鉴定了一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221678，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。该菌株用于表达几丁质酶，可以几丁质为唯一碳源，且受到几丁质的强烈诱导表达，在几丁质废弃物转化为高附加值产品工业中具有极大的应用潜力。该菌株表达的几丁质酶pH稳定性和温度稳定性较好，在工业生产中有较大的优势，可应用于农业、食品、化妆品和医药领域，具有极大的应用推广价值。
附图说明
[0016]图1所示的是本专利技术实施例1中J5菌株在胶体几丁质平板培养基上的水解圈图；
[0017]图2所示的是本专利技术实施例2中J5菌株16S rDNA序列的系统发育树；
[0018]图3所示的是本专利技术实施例3中J5菌株在不同培养基培养中几丁质酶的活性差异图；
[0019]图4所示的是本专利技术实施例5几丁质酶的最适温度(A)曲线图；
[0020]图5所示的是本专利技术实施例5几丁质酶的温度稳定性(B)曲线图；
[0021]图6所示的是本专利技术实施例6几丁质酶的最适pH(A)曲线图；
[0022]图7所示的是本专利技术实施例6几丁质酶的pH稳定性(B)曲线图。
具体实施方式
[0023]实施本专利技术的技术方案如下：
[0024]实施例1：海洋来源的沙雷氏菌株的筛选
[0025]1、利用自然海水或人工配制的海水配制胶体几丁质培养基(以几丁质为唯一碳源的培养基)：胶体几丁质4g，硫酸铵2g，磷酸高铁0.1g，琼脂15g，海水或人造海水1000mL，自然PH。其做法是先配制胶体几丁质，称取5g几丁质，加预冷过的浓HCl 100mL，搅拌至溶解，倒入300mL预冷无水乙醇，边加边搅拌，离心去除上清，用蒸馏水洗涤沉淀，直至中性，即制成胶体几丁质。称取胶体几丁质4g，硫酸铵2g，磷酸高铁0.1g，加海水溶解，加入琼脂15g，加热，待琼脂溶解完后，稍冷却后补足海水至1000mL，分装锥形瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出摇匀，冷却到60℃左右，配制平板，凝固后4℃冰箱贮存备用。
[0026]2、降解几丁质菌株的筛选
[0027]将从浙江省宁波市象山县周围海洋滩涂所取样品用无菌海水或人造海水搅拌6h后，取样涂布于上述几丁质唯一碳源平板培养基，30℃倒置培养2
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5天，观察菌落生长及透明圈产生情况。挑取产透明圈的菌株在新的胶体几丁质培养基上纯化出单菌落，并比较透明圈的大小，将透明圈最明显的菌落标记为J5。
[0028]实施例2：降解几丁质菌株的鉴定
[0029]1、细菌DNA基因组提取
[0030]取细菌培养液离心收集菌体,选用翊圣商品化细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取。取一定量的DNA提取液，在K5500 plus超微量分光光度计(北京凯奥)上测定其纯度和含量，根据结果将核酸浓度稀释至适合的PCR用模板浓度100～300ng/μL。
[0031]2、16S rDNA扩增、测序与分析
[0032]PCR反应体系：Mix(dNTP、酶、Mg
2+
、10
×
buffer)25μL，27F引物(100μM)1μL，1492R引物(100μM)1μL，基因组DNA模板2μL，无菌水21μL。PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用EasyPure PCR Purification Kit纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)对目的PCR产物进行回收纯化。将回收的目的核酸片段送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后进行测序，测得的序列如SEQ ID NO：1所示。将测得的序列用NCBI的BLAST程序与GENBANK数据库中的细菌16S rDNA序列进行比对，通过BLAST工具和DNAMAN软件进行比对分析并用Mega 7.0软件Neighbor
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株，其特征在于：该菌株为海洋沙雷氏菌J5，其分类命名为Serratia sp.，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为：CCTCC NO:M 20221678。2.根据权利要求1所述的一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株，其特征在于：所述沙雷氏菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1。3.根据权利要求1所述的一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株，其特征在于：所述沙雷氏菌是从浙江宁波沿海及滨海湿地水样及腐殖质中分离得到的。4.根据权利要求1～3所述的一株海洋来源的产几丁质酶的沙雷氏菌株，其特征在于：该菌株的筛选限制性培养基为天然海水配制的几丁质培养基(g/L)：几丁质粉末10.0，硫酸铵2.0，磷酸高铁0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴丽双，王芙蓉，
申请(专利权)人：浙江药科职业大学，
类型：发明
国别省市：