一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法。所述构建方法包括：获得cDNA、PCR扩增、建库；所述获得cDNA包括制备油包水和反转录；所述制备油包水包括：混合细胞相、beads相和油相；所述细胞相、beads相和油相的体积比为(3～4)：(5.5～6.5)：(21～23)。本发明专利技术优化反转录的油包水体系使得海洋生物单细胞在形成油包水进行反转录时不易破碎，在测序后可以得到质量较优的测序数据，显著提高海洋细胞检测效率和准确率。显著提高海洋细胞检测效率和准确率。显著提高海洋细胞检测效率和准确率。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法。

技术介绍

[0002]转录组测序的研究对象为某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列的总和，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，可以应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
[0003]而单细胞转录组测序则是可以在单细胞水平进行测序，可以研究不同单细胞的异质性，但是目前海洋生物细胞在进行单细胞转录组测序时采用和其他类型细胞相同的测序方式时，存在测序质量较低的缺陷，难以实现样本中单个细胞之间的异质性的研究。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法。通过调整细胞相和beads相的渗透压和体系，使细胞能够保持较完整的形态进入到油包水中，保证较优的测序质量。
[0005]第一方面，本专利技术一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法，包括：获得cDNA、PCR扩增、建库；
[0006]所述获得cDNA包括制备油包水和反转录；所述制备油包水包括：混合细胞相、beads相和油相；
[0007]所述细胞相、beads相和油相的体积比为(3～4)：(5.5～6.5)：(21～23)。
[0008]进一步，所述beads相中的beads为DG1000
‑
3'gel beads；和/或，所述油相中的油为Partitioning Oil。
[0009]进一步地，所述beads相中的beads连接有barcode序列和反转录引物；
[0010]所述反转录引物包括如下核苷酸序列：
[0011]5’‑
CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNVTVNNNNNNNTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
‑3’
。
[0012]进一步地，所述反转录的流程包括：
[0013]42～45℃持续85～95分钟和82～88℃持续5～7分钟。
[0014]进一步地，所述PCR扩增的反应程序如下：
[0015]95℃，30s；95℃，15s；62℃，15s；65℃，3min，进行12～15次循环；65℃，5min；4℃以下保持。
[0016]进一步地，所述建库包括：
[0017]打断、末端修复，加测序接头、连接index及PCR反应，片筛及测序。
[0018]进一步地，所述海洋生物包括牡蛎、海鞘、扇贝或紫菜中的一种或多种。
[0019]本专利技术进一步提供所述的构建方法在筛选抑制海洋生物细胞中的应用。
[0020]本专利技术具备如下有益效果：
[0021]本专利技术针对海洋生物细胞的特点，提供了一种特定的油包水体系，该油包水体系具有和海洋生物单细胞适宜的渗透压和其他环境体系，能够使得细胞保持较为完整的形态进入到油包水中，从而实现不同海洋单细胞带上不同baorcod序列进行测序，而且测序得到的测序数据质量较高，显著提高了测序效率。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1是本专利技术实施例1提供的加入混合细胞相、DG1000
‑
3'gel beads及Partitioning Oil的加入量及位置示意图。
[0024]图2是本专利技术实施例1提供的对纯化后PCR产物峰型进行测定的结果示意图。
[0025]图3是本专利技术实施例1提供的文库峰图的结果示意图。
具体实施方式
[0026]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术中的附图，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0027]以下实施例中涉及的试剂如下：
[0028]SuperScript III reverse transcriptase、5
×
RT Buffer、dNTP、RNaseOUT、0.1M DTT、Dynabeads磁珠购自赛默飞；TSO(GGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG)、DG1000
‑
3'gel beads引物序列(CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN)、cDNA引物(F：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT；R：CTACACGACGCTCTTCCGAT)由生工生物合成，稀释至10uM使用；DPBS购自Gibco；SPRI磁珠购自贝克曼；High sensitivity Agilent Technologies 2100Bioanalyzerd购自安捷伦；Amp Mix、末端修复试剂、接头连接试剂购自NEB；无核酶水购自天根；80％乙醇溶液现用现配。
[0029]实施例1
[0030]1、将单细胞悬液与逆转录试剂混合，制备细胞相
[0031]1.1按照下表配制RT mix：
[0032]表1 RT反应体系
[0033]试剂用量/ul5
×
RT Buffer7dNTP3RNaseOUT2TSO20.1M DTT1
SuperScript III reverse transcriptase510x DPBS8.6
[0034]TSO引物序列：GGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG。
[0035]1.2制备细胞mix
[0036]根据要检测的细胞量(1
‑
2万个细胞)及细胞浓度配制细胞mix体系：
[0037]表2细胞mix体系
[0038]试剂用量/ul细胞X3x PBS6.4
‑
X
[0039]2、制备油包水，进行反转录
[0040]2.1加入细胞相mix、DG1000
‑
3'gel beads及Partitioning Oil。加入量及位置，见图1(DG1000
‑
3'gel beads的加入量为60μL，细胞相mix为35μL，Partitioni ng Oil为220μL)。DG1000
‑
3'gel beads中引物序列：CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物单细胞转录组文库的构建方法，其特征在于，包括：获得cDNA、PCR扩增、建库；所述获得cDNA包括制备油包水和反转录；所述制备油包水包括：混合细胞相、beads相和油相；所述细胞相、beads相和油相的体积比为(3～4)：(5.5～6.5)：(21～23)。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞相包括海洋生物细胞和3
×
PBS；所述细胞和所述3
×
PBS的体积比为(1～6.4)：(6.4～1)。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述beads相中的beads为DG1000
‑
3'gel beads；和/或，所述油相中的油为Partitioning Oil。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述beads相中的beads连接有barcode序列和反转录引物；所述反转录引物包括如下核苷酸序列：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘敏，齐双慧，张坦，
申请(专利权)人：青岛百创智能制造技术有限公司，
类型：发明
国别省市：