水稻基因ORYsa;SHR2的基因工程应用制造技术

本发明专利技术公开了水稻基因ORYsa；SHR2的基因工程应用。包括该基因在提高土壤中磷素吸收效率方面和增强水稻分蘖发生能力的应用。本发明专利技术基因为水稻中磷素吸收方面的首次报道，在提高土壤中磷素吸收效率方面起着重要作用。ORYsa；SHR2敲除后可提高磷吸收效率29％～48％，且提高了水稻分蘖发生的能力，为培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。土壤的水稻新品种提供了保障。土壤的水稻新品种提供了保障。

【技术实现步骤摘要】
水稻基因ORYsa；SHR2的基因工程应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，涉及水稻基因ORYsa；SHR2的基因工程应用。

技术介绍

[0002]磷(P)素是植物生长和发育所必需的大量营养元素，除了作为植物体内核酸、ATP、磷脂等生物大分子的重要组成部分外，还参与植物光合作用、物质代谢和能量传递等过程(Raghothama,1999；Poirier and Bucher,2002；L
ó
pez
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Arredondo et al.,2014)。自然土壤中磷素有效性很低，对于绝大多数作物生产活动来说都是缺乏的(Bieleski,1973)。而且，作物对于磷肥的利用率也特别低，低效的利用率导致了农业生产中磷肥必须得大量施用；而在自然界中生产磷肥所用的磷矿石是不可再生资源，科学家预计低成本的磷肥资源将在2050年左右耗尽(Vance et al.,2003)，除此之外，磷肥还会通过淋失，水体运动等过程流入到其它生态系统中，导致水体富营养化等一系列的生态环境问题(L
ó
pez
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Arredondo et al.,2014；Liu et al.,2016)。故当前土壤缺磷和磷肥施用过剩已成为制约农作物产量和资源浪费与环境破坏的关键因素之一。
[0003]SHR是一类植物特有的转录因子蛋白，研究发现其在拟南芥根的中柱细胞中表达，其蛋白可以从中柱细胞移动到相邻的内皮层细胞，从而激活该层细胞中AtSCR的表达，最终与AtSCR蛋白共同调控拟南芥根系细胞的不对称平周分裂过程(Helariutta et al.,2000；Nakajima et al.,2001)。虽然在拟南芥等物种中SHR
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SCR模块在内皮层的特异表达是内皮层与皮层细胞分化不同的分子保障，但是在最近的研究中，人们却发现豆科植物中SHR
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SCR模块能够在皮层细胞中特异表达，且这种特异表达与固氮菌共生具有紧密联系，是豆科植物根系与固氮菌能够共生的分子基础(Dong et al.,2020)，进一步研究显示GmSHR4/5直接激活下游D
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型细胞周期蛋白(GmCYCD6；1
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6)形成前馈环，从而调控大豆根瘤原基起始分裂的关键机制(Wang et al.,2021)。但现有技术尚未公开ORYsa；SHR2对磷素吸收和水稻分蘖的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供水稻转录因子基因ORYsa；SHR2的基因工程应用，该基因在水稻中敲除提高水稻磷素吸收利用和促进水稻分蘖。
[0005]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0006]水稻转录因子基因ORYsa；SHR2的基因工程应用，在水稻中敲除水稻转录因子基因ORYsa；SHR2能够提高水稻磷素吸收利用、促进水稻分蘖和/或降低株高，所述的水稻转录因子基因ORYsa；SHR2在NCBI的基因序列登录号为XM_015773807.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_015773807.2？report＝fasta)。
[0007]敲除或沉默ORYsa；SHR2基因的物质在提高水稻磷素吸收利用、促进水稻分蘖和/或降低株高中的应用。
[0008]作为本专利技术的一种优选，所述的敲除或沉默ORYsa；SHR2基因的物质为针对ORYsa；
SHR2基因的CRISPR/Cas9基因敲除系统，或者ORYsa；SHR2基因的siRNA。
[0009]有益效果
[0010]本专利技术基因ORYsa；SHR2的功能为水稻磷素吸收中的首次报道，在提高土壤中磷素吸收利用效率方面起着重要作用。ORYsa；SHR2作为目的基因在水稻中敲除，其突变可提高磷吸收，提高了水稻根系对磷的吸收速率，促进水稻分蘖发生，且降低水稻株高，为培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
附图说明
[0011]图1.OsSHR2基因的时空表达模式
[0012]图2.ORYsa；SHR2基因在缺素条件下的表达模式鉴定
[0013]图3.ORYsa；SHR2突变体和野生型水稻地上部和地下部干物重
[0014]图4.ORYsa；SHR2突变体和野生型水稻植株各部位的总磷含量浓度
[0015]图5.ORYsa；SHR2突变体和野生型水稻株高、分蘖性状
[0016]图6.RYsa；SHR2突变体和野生型水稻扬花期和成熟期不同部位总磷浓度
[0017]图7.ORYsa；SHR2基因编辑载体
具体实施方式
[0018]实施例1、基因序列的获得
[0019]申请人在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上输入XM_015773807.2得到一段编码GRAS家族转录因子基因的DNA序列。
[0020]实施例2、ORYsa；SHR2的表达模式鉴定
[0021]2.1、总RNA的提取和逆转录合成cDNA第一链
[0022]选用水稻品种“日本晴”，待水稻幼苗长至10天后，完全营养液培养1周后使用不同缺素营养液再处理1周后采样。水稻不同生育期采取不同部位样品。采用TriZol试剂抽提总RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模版，经过逆转录获得水稻cDNA，供后续的实验使用。cDNA第一链的合成步骤按照诺唯赞生产的HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒说明书进行。
[0023]2.2、ORYsa；SHR2基因的组织特异性表达模式鉴定
[0024]以步骤2.1获得的“日本晴”cDNA为模板，根据水稻OsSHR2基因的编码序列，设计以下特异引物P1、P2，扩增长度为136bp产物，鉴定OsSHR2基因的表达模式。
[0025]P1 GCAAATCATCGAGCCTGCG
[0026]P2 CGTACGTTGCTGGCTGAAAAA
[0027]PCR具体步骤根据诺唯赞生产的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR试剂盒说明书进行；仪器使用本实验室购置的QuantStudio 6Pro Real
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Time PCR System(Thermo FisherScientific)。使用OsActin1基因作为内参基因。定量结果根据2
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ΔC
t方法计算分析OsSHR2基因的时空表达模式，结果见图1。
[0028]由图1可以看出，OsSHR2在营养生长阶段主要表达在根部，而生殖生长阶段在茎杆，种子器官中表达较高。
[0029]2.3、ORYsa；SHR2基因在缺素条件下的表达模式鉴定
[0030]总RNA提取、反转录，荧光定量PCR方法同2.1、2.2。用于检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水稻转录因子基因ORYsa；SHR2的基因工程应用，其特征在于在水稻中敲除水稻转录因子基因ORYsa；SHR2能够提高水稻磷素吸收利用、促进水稻分蘖和/或降低株高，所述的水稻转录因子基因ORYsa；SHR2在NCBI的基因序列登录号为XM_015773807.2。2.敲除或沉默ORYs...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙淑斌，王小文，胡志，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：