一种β-甘露聚糖酶基因的表达及在黄芪多糖提取中的应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学与酶法提取领域，涉及一种新型β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
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甘露聚糖酶基因的表达及在黄芪多糖提取中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学与酶法提取领域，涉及一种新型β
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甘露聚糖酶基因的表达、纯化及在黄芪发酵中提取黄芪多糖的应用。

技术介绍

[0002]β
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甘露聚糖酶(β
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mannanase EC 3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶，以内切的方式降解来β
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1,4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β
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甘露聚糖等。β
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甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物。
[0003]β
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甘露聚糖酶不仅能分解β
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甘露聚糖、降低消化道内容物的粘度，而且其分解β
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甘露聚糖产生的甘露低聚糖，能够作为双歧杆菌的增殖因子、促进肠道内有益菌群的增殖。β
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甘露聚糖酶还可以用做饲料添加剂，已在饲料工业中有广泛的应用。在食品工业中，β
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甘露聚糖可以用于生产甘露低聚糖及其它食品加工中。在造纸工业中，将β
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甘露聚糖酶和木聚糖酶等协同使用可以减少氯的环境污染。在医药方面，β
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甘露聚糖酶对高血脂症、预防动脉硬化和冠心病有一定预防作用。
[0004]黄芪是多年生豆科植物，具有补气升阳等功效。药理学研究表明，黄芪多糖在免疫调节、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、延缓衰老等诸多方面均具有很好的生物学活性，在医药领域具有良好的开发前景。黄芪多糖是黄芪药材中含量最多、免疫活性最强的一类物质。由于酶解具有专一性，并且黄芪多糖与结构多糖所含糖苷键不同，目前急需寻找提高黄芪多糖提取率的酶，针对性地分解黄芪细胞壁，快速释放细胞内部物质。

技术实现思路

[0005]针对目前技术现状，本专利技术主要解决的技术问题是提供一种β
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甘露聚糖酶在黄芪发酵中提取黄芪多糖的应用，通过高效表达后能够达到较高的发酵和提取水平。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]所述β
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甘露聚糖酶基因的表达方法及酶法提取黄芪多糖的应用工艺包括如下步骤：
[0008]步骤一、将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列重组、构建到pET
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28a(+)载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；
[0009]步骤二、表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.2mM的IPTG诱导；发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性的β
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甘露聚糖酶采用Ni
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NTA亲和层析柱进行蛋白纯化得到较纯的β
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甘露聚糖酶，并对β
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甘露聚糖酶最适温度和最适pH进行测定。
[0010]步骤三、将黄芪药材烘干、粉碎过20
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40目筛后，经乙醇等有机溶剂回流脱脂过滤，滤渣挥干溶剂后备用。滤渣浸泡于添加了上述β
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甘露聚糖酶制剂的水溶液中，根据酶来选择反应的温度和pH。加热上述混合物，过滤收集滤液，得到黄芪多糖提取物A。
[0011]步骤四、将步骤三所得滤渣浸泡于添加了β
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甘露聚糖酶制剂的水溶液中，加热上
述混合物，过滤收集滤液，得到黄芪多糖提取物B。
[0012]步骤五、将步骤三、四所得黄芪多糖提取物A、B混合，加入乙醇调节，沉淀出黄芪多糖固体，将黄芪固体粉碎得到黄芪多糖粗品。采用苯酚
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硫酸法测定多糖含量。
[0013]本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术将序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列利用pET
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28a(+)载体和大肠杆菌表达菌株实现了一种新的β
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甘露聚糖酶的表达，得到大量β
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甘露聚糖酶蛋白，并将其用于黄芪多糖的提取；通过本专利技术所提供的蛋白制备方法得到的β
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甘露聚糖酶蛋白稳定性好、具有很强的生物活性。pH8.5，50℃下的比活力为500U/mg蛋白，能够高效分解黄芪中的β
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甘露糖苷键，使得反应体系黏度降低，有利于对黄芪中黄芪多糖的充分分离和提取，且酶解后的体系仅经醇沉、干燥即可得黄芪多糖。精简的操作步骤不仅大大减少了黄芪多糖的损失率，而且有利于规模化生产。
[0014]该β
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甘露聚糖酶基因是一种新发现的基因，目前还没有对其进行研究开发的报道。因此，通过表达纯化方法高效生产β
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甘露聚糖酶，加入该β
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甘露聚糖酶，不但可有效将细胞壁水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，还能裂解糖苷键，达到提取黄芪多糖的目的同时，有效提高黄芪多糖成分的提取率。
[0015]本专利技术所述β
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甘露聚糖酶的核苷酸序列见序列表中序列1。
附图说明
[0016]图1为β
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甘露聚糖酶基因的表达产物的SDS
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PAGE图。其中，泳道1为大肠杆菌超声后的破碎液；泳道2为超声后的破碎液上清；泳道3为破碎液沉淀；泳道M为蛋白Marker；其他泳道为纯化后蛋白的电泳结果(由上到下的条带依次代表180、140、100、70、55、40、35、25kDa)，目的蛋白在图中有箭头指出。图2为β
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甘露聚糖酶蛋白在不同温度下的酶活力曲线，50℃为β
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甘露聚糖酶最适反应温度。
[0017]图3为β
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甘露聚糖酶蛋白在不同pH下的酶活力曲线，pH5.0～6.0测定缓冲液为终浓度为100mM的磷酸氢二钠
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柠檬酸缓冲液；pH6.0～9.0测定缓冲液为终浓度100mM Tris
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HCl缓冲液；pH9.0～pH10.0测定缓冲液为终浓度100mM甘氨酸
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氢氧化钠缓冲液，其中最适pH为8.5。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不限于本专利技术的范围。
[0019]实验仪器、材料和试剂
[0020]1、实验仪器:电子天平、、真空干燥箱、恒温水浴锅、粉碎机、离心机、PCR仪
[0021]2、菌株与载体、试剂
[0022]大肠杆菌菌株Top10、BL21(DE3)、载体pET
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28a(+)均购买于购自安徽吐露港生物科技有限公司；无水乙醇、蒸馏水、黄芪、甘露聚糖(SigmaG7053)购自Sigma。
[0023]3、酶与试剂盒
[0024]高保真酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，重组酶购自安徽吐露港生物科技有限公司，DNeasy P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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甘露聚糖酶，其特征在于，其DNA核酸序列具有序列表中SEQ ID NO：1的脱氧核糖核酸序列。2.一种载体，其特征在于，其含有如权利要求1所述的DNA分子。3.一种宿主细胞，其特征在于，其含有如权利要求1所述的DNA分子，或者权利要求2所述的载体。4.如权利要求1所述的β
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甘露聚糖酶的应用，其特征在于，将其添加到黄芪中提取黄芪多糖。5.如权利要求4所述的β
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甘露聚糖酶的应用，其特征在于，通过如下步骤实现：（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏勇军，苗琴，张晓玲，屈凌波，高健，程晓辉，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：