一种检测伪狂犬病毒的LAMP检测引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测伪狂犬病毒的LAMP检测引物组及其应用，属于生物技术领域。该伪狂犬病毒LAMP检测引物组包括如SEQ ID NO.1所示的F3、如SEQ ID NO.2所示的B3、如SEQ ID NO.3所示的FIP和如SEQ ID NO.4所示的BIP。本发明专利技术使用的引物设计位置位于伪狂犬病毒gB段，能降低因引物位于高突变区位点而造成的扩增失败，并且使用LAMP对伪狂犬病毒进行扩增，使检测变得更加简洁方便，同时又能应用于养殖临床一线的检测。床一线的检测。床一线的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测伪狂犬病毒的LAMP检测引物组及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种检测伪狂犬病毒的LAMP检测引物组及其应用。

技术介绍

[0002]动物疫苗是畜禽用于预防和控制传染性疾病的产品，其生产水平及质量安全与维护动物健康和人类安全密切相关。与普通药品相比，疫苗具有生产工艺复杂、生产周期长、对生产环境要求高等特点。只有有效识别疫苗生产全过程中的各种风险，才能够全面控制影响疫苗质量的因素，保证产品的质量和安全。
[0003]交叉污染是疫苗生产过程中最常见的生产风险。在疫苗生产全过程中，物料及菌毒种的领用、投料、配制、分装、冻干、交接、清场等均存在交叉污染的风险，从而影响疫苗的安全，产生产品报废、生产成本增加、生产周期加长等不利影响。
[0004]伪狂犬病毒(Pesudorabies Viurs，PRV)是伪狂犬病的病原，可引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎和产弱仔，以及初生仔猪高发病率和死亡率。该病在世界各地广泛分布，到目前已经有50多个国家和地区对该病的流行进行了报道，给全球养猪业造成了巨大的威胁。
[0005]目前，疫苗生产过程中诊断外源病毒污染的方法有细胞培养和分子生物学两种方法。细胞培养法的检测周期长，严重影响疫苗的生产周期，同时检测结果易被主观因素所影响。分子生物学方法包括常规PCR或实时荧光定量PCR，两者检测的精准度能够达到99％以上，但是这两种方法均需要价格高昂的检测仪器，且需要专业的人士进行操作和结果判读，所以目前主要在高校、科研院所和专业检测的企业中使用。
[0006]因此，获得一种使伪狂犬病毒的检测摆脱繁琐的实验过程以及昂贵仪器的束缚，使伪狂犬病毒检测变得更加简洁方便，更加灵活，同时又能应用于动物疫苗生产一线中对伪狂犬病毒污染的快速检测的方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种检测伪狂犬病毒的LAMP检测引物组及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过设计LAMP检测引物、构建LAMP检测体系，摆脱了繁琐的实验过程以及昂贵仪器的束缚，使得伪狂犬病毒检测变得更加简洁方便，更加灵活，同时又能应用于动物疫苗生产一线中对伪狂犬病毒污染的快速检测。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]本专利技术提供一种伪狂犬病毒的LAMP检测引物组，包括如SEQ ID NO.1所示的引物F3、如SEQ ID NO.2所示的引物B3、如SEQ ID NO.3所示的引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的引物BIP。
[0010]本专利技术还提供一种LAMP检测引物组在制备检测伪狂犬病毒的产品中的应用。
[0011]进一步的，所述产品为试剂或试剂盒。
[0012]本专利技术还提供一种伪狂犬病毒检测产品，包括权利要求1所述的LAMP检测引物组。
[0013]进一步的，所述伪狂犬病毒检测产品还包括反应缓冲液、钙黄绿素、MnCl2、MgSO4、甜菜碱、DNAPolymerase、ddH2O和dNTP。
[0014]进一步的，所述伪狂犬病毒检测产品的反应体系为：2.5μL 10
×
Reaction Buffer、0.5
‑
4μLdNTP、0.5
‑
3μL甜菜碱、0.5
‑
2.5μL MgSO4、1
‑
2μL MnCl2、1
‑
2μL钙黄绿素、1μL ddH2O、0.5
‑
1μLF3、0.5
‑
1μLB3、1
‑
4μLFIP、1
‑
4μLBIP、1μLDNAPolymerase和1μL模板DNA。
[0015]进一步的，所述反应体系为：2.5μL 10
×
Reaction Buffer、2.5μL dNTP、2μL甜菜碱、1.5μLMgSO4、1.5μLMnCl2、1.5μL钙黄绿素、1.5μL ddH2O、F3/B3各1μL、FIP/BIP各4μL、1μLDNAPolymerase和1μL模板DNA。
[0016]本专利技术还提供一种所述的LAMP检测引物组或所述的伪狂犬病毒检测产品在伪狂犬病毒疫苗质量检测中的应用。
[0017]在应用了高效的有链置换活性的Bst DNA聚合酶后，使LAMP可以在等温条件快速反应从而具备了高效性。通过敏感性与特异性的比较，LAMP方法与PCR方法完全相同。而在对临床样本的检测中，LAMP方法的检出率更高，结果表明LAMP方法在临床应用可能比PCR方法更有优势。
[0018]本产品扩增产物的检测方法主要采用了显色反应。在LAMP反应进行的过程中，伴随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子。钙黄绿素荧光显色剂的工作原理是钙黄绿素与副产物焦磷酸根离子发生作用。反应之初钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素就可自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。如果钙黄绿素的浓度与锰离子浓度合适，荧光显色判断结果就可以与浊度仪判断结果一致。荧光显色剂的应用更简捷、更直观：直接加入反应体系，不需要额外的仪器和设备；结果可以直接肉眼观察，显色明显。并且自反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的假阳性的产生。
[0019]在体系中添加甜菜碱的原因，是因为甜菜碱可以帮助DNA顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA上脱落，若DNA局部区域因含有多个复杂碱基(Py
‑
C
‑
G)，会促使DNA聚合酶停滞，最终导致DNA停止有效延伸，而甜菜碱可以提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和腺嘌呤区域的鸟嘌呤与腺嘌呤的水合作用，改变DNA分子灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。而且甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性，降低高GC含量对Tm的影响，使LAMP中引物Tm相接近。
[0020]本专利技术公开了以下技术效果：
[0021]1、本专利技术使用LAMP对伪狂犬病毒进行扩增，使检测变得更加简洁方便，同时又能应用于养殖临床一线的检测。
[0022]2、本专利技术使用的引物设计位置位于伪狂犬病毒gB段，能降低因引物位于高突变区位点而造成的扩增失败。
[0023]3、本专利技术使用两组引物，大大提高本专利技术对伪狂犬病毒的特异性。
[0024]4、本专利技术使用了钙黄绿素这一荧光显色剂，使结果判断更加直接可观。
[0025]5、在原有技术上优化了实验步骤，省略了中间热激环节，降低了重复开盖导致气溶胶污染的几率。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒的LAMP检测引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的引物F3、如SEQ ID NO.2所示的引物B3、如SEQ ID NO.3所示的引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的引物BIP。2.一种如权利要求1所述的LAMP检测引物组在制备检测伪狂犬病毒的产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。4.一种伪狂犬病毒检测产品，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP检测引物组。5.根据权利要求4所述的伪狂犬病毒检测产品，其特征在于，所述伪狂犬病毒检测产品还包括反应缓冲液、钙黄绿素、MnCl2、MgSO4、甜菜碱、DNAPolymerase、ddH2O和dNTP。6.根据权利要求5所述的伪狂犬病毒检测产品，其特征在于，所述伪狂犬病毒检测产品的反应体系为：2.5μL10
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ReactionBuffer、0.5
‑
4μLdNTP、0.5
‑
3μL甜菜碱、0.5
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【专利技术属性】
技术研发人员：包银莉，王燚，廖苗苗，曾旭健，黄翠琴，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：