一种双孢蘑菇甲基化转移酶AbDNMT2基因、重组载体和表达方法技术

本发明专利技术公开了一种双孢蘑菇甲基化转移酶AbDNMT2基因、重组载体和表达方法，分析鉴定了双孢蘑菇中的甲基化转移酶AbDNMT2基因；通过同源重组法将AbDNMT2基因插入至pET

【技术实现步骤摘要】
一种双孢蘑菇甲基化转移酶AbDNMT2基因、重组载体和表达方法


[0001]本专利技术涉及一种双孢蘑菇甲基化转移酶AbDNMT2基因及其重组载体和表达方法，属于生物


技术介绍

[0002]双孢蘑菇(Agaricus bisporus(Large)Sing.)，又名洋蘑菇、白蘑菇，是担子菌门、伞菌目、伞菌科、蘑菇属的一种可食用菌种。因其具有优质蛋白质，高纤维，大量维生素和矿物质，已经成为了世界上栽培地区最广、生产规模最大、消费最普遍的一种食用菌，同时也是生理学特性和栽培技术研究最全面、最深入的物种。双孢蘑菇属于生理活性很强的菌类，具有易褐变、易衰老变质、易腐烂等特点，是难以贮藏的食用菌，其采后在很短的时间内就会发生褐变，使其对贮运保鲜要求高，一般需要冷链物流，如贮运不当或不能及时销售，易造成损失。目前对于双孢蘑菇的抗褐化措施主要集中在采后保鲜方面，例如中国专利CN100536670C公开了双孢蘑菇保鲜剂，能将双孢蘑菇的保鲜期延长至10天以上。但是这些方法又可能存在食品添加剂超标的问题，因此在基因层面研究清楚双孢蘑菇褐化的机制，并采用表观遗传学的方法来实现双孢蘑菇得抗褐化将会成为研究的重点关注领域。
[0003]表观遗传学是指在DNA序列不发生变化的条件下，基因组的功能发生变化，产生这种变化的机制一般有DNA甲基化和组蛋白修饰，各自改变基因的表达。这种表观遗传学变化在细胞生命周期中可以通过细胞分裂持续下去，甚至可以遗传多代。
[0004]DNA甲基化是指活化的甲基(CH3)从S
‑/>腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶残基的第5位碳(5mC)上的过程，该反应由具有DNA甲基化酶保守结构域作为催化结构域的DNA甲基转移酶催化。DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase)，是催化DNA甲基化的关键因子，其从S
‑
腺苷甲硫氨酸(SAM)中招募甲基，随后结合到胞嘧啶残基(5mC)的第5个碳。DNA甲基化发生在CpG岛和基因体上，以调节基因表达，从而在真核生物的发育阶段介导不同的生物过程。目前对DNA甲基化、DNA甲基化转移酶的研究主要集中在植物、动物和子囊菌中，但是关于DNA甲基化是如何参与担子菌发育，特别是在具有重要价值的蘑菇中的研究很少。王佩对双孢蘑菇转化体系以及子实体褐化转录组进行了研究分析，找到了褐化相关的差异表达基因，为进一步研究双孢蘑菇有褐化相关基因的表达模式等提供了数据支撑(双孢蘑菇转化体系研究及子实体褐化转录组分析，王佩，三峡大学，2019.)；黄蕊蕊对平菇中DNA甲基化转移酶进行了鉴定和初步研究，发现DNA甲基化在蘑菇生长过程中可能发挥重要的调控作用，为将来了解蘑菇中的甲基化提供了参考(平菇中DNA甲基转移酶的鉴定及初步研究，黄蕊蕊，南京农业大学，2017.)。
[0005]随着高通量测序技术的发展，越来越多的蘑菇基因组被测序，这为我们探索食用菌发育和繁殖过程中甲基化的机制提供了新的思路，但是目前对双孢蘑菇的DNA甲基化、甲基化转移酶基因的研究仍然十分有限，并且获取双孢蘑菇DNA甲基化转移酶蛋白的效率仍需要提高。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的提供一种双孢蘑菇甲基化转移酶AbDNMT2基因、重组载体和表达方法。本专利技术从23个食用菌中分析获得了双孢蘑菇AbDNMT2基因为编码DNA甲基化转移酶的基因，并且利用该基因构建了重组原核表达载体、获得了重组菌，并利用重组菌进行了诱导表达，最终获得了在体外具有甲基化活性的AbDNMT2蛋白。
[0007]本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供一种甲基化转移酶AbDNMT2基因，AbDNMT2基因来源于双孢蘑菇，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0009]本发还提供一种甲基化转移酶AbDNMT2基因的重组原核表达载体，所述重组原核表达载体由上述的AbDNMT2基因的核苷酸序列通过HindIII和SacI酶切位点插入pET
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32a载体重组而成，得到重组原核表达载体pET
‑
32a
‑
AbDNMT2。
[0010]优选的，AbDNMT2基因与His
‑
tag标签融合。
[0011]本专利技术还提供一种含有甲基化转移酶AbDNMT2基因的重组菌，所述重组菌为将重组原核表达载体pET
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32a
‑
AbDNMT2转化入宿主菌制备而成。
[0012]优选的，宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株或大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
[0013]本专利技术还提供一种重组表达甲基化转移酶AbDNMT2基因的方法，培养含有重组原核表达载体pET
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32a
‑
AbDNMT2的大肠杆菌BL21(DE3)重组菌，采用IPTG作为诱导剂进行诱导表达，再收集表达的AbDNMT2蛋白。
[0014]优选的，采用IPTG作为诱导剂时，培养基为LB培养基，培养基中含有50
‑
100μg/mL氨苄霉素，进一步优选的氨苄霉素的浓度为80μg/mL。
[0015]进一步优选的，IPTG的终浓度为0.2
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0.8mM，进一步优选的IPTG的终浓度为0.2mM。
[0016]优选的，重组菌的接种量为1
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2％(v/v)，诱导温度为16
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37℃，诱导时间为4
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12h，摇床转速为160
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200rpm.
[0017]进一步优选的，接种量为1％(v/v)诱导温度为16℃，诱导时间为12h，摇床转速为180rpm。
[0018]本专利技术的有益效果在于：
[0019]1、本专利技术依据DNA甲基化转移酶包含DNA甲基化酶保守结构域这一特征，通过生物信息学的分析将鉴定到的食用真菌中的DNMT2和已报道的DNMT2蛋白具有较高的同源性和序列相似性，并在食用菌基因组数据库中鉴定了多个甲基化转移酶基因，并通过这些基因编码蛋白质的系统发育分析和结构域分析揭示了食用菌的进化保守性。
[0020]2、本专利技术在双孢蘑菇的基因组中发现了一个只含有DNA甲基化酶保守结构域的甲基化转移酶AbDNMT2基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，同时还发现AbDNMT2基因与Agrocybe aegerita中的AaDNMT2基因亲缘关系最接近。
[0021]3、本专利技术通过逆转录得到的双孢蘑菇的cDNA，以其为模板克隆得到的AbDNMT2基因，然后以pET
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32a为载体骨架，通过同源重组法将AbDNMT2基因插入到载体中，构建得到了含有AbDNMT2基因的重组原核表达载体，并将重组原核表达载体转入大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得了重组菌。用IPTG作为诱导剂诱导重组大肠杆菌BL21(DE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲基化转移酶AbDNMT2基因，其特征在于：所述AbDNMT2基因来源于双孢蘑菇，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。2.一种甲基化转移酶AbDNMT2基因的重组原核表达载体，其特征在于：所述重组原核表达载体由权利要求1所述的AbDNMT2基因的核苷酸序列通过HindIII和SacI酶切位点插入pET
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32a载体重组而成，得到重组原核表达载体pET
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32a
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AbDNMT2。3.根据权利要求2所述的重组原核表达载体，其特征在于：所述AbDNMT2基因与His
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tag标签融合。4.一种含有甲基化转移酶AbDNMT2基因的重组菌，其特征在于：所述重组菌由权利要求2所述的重组原核表达载体转化入宿主菌制备而成。5.根据权利要求4所述的一种含有甲基化转移酶AbDNMT2基因的重组菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株或大肠杆菌BL21(DE3)菌株。6.一种重组表达甲基化...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈祥陵，李贵轩，韩少鹏，曾弓剑，胡永峰，秦心儿，吕阳，邓竹英，
申请(专利权)人：湖北索敢科技有限公司，
类型：发明
国别省市：