一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法技术

本发明专利技术公开一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②ｈＰＢＭＣ制备，③组织培养液与ｈＰＢＭＣ共培养，④ＥＬＩＳＡ检测ＴＮＦ－α及ＩＦＮ－γ，⑤ＭＴＴ检测ｈＰＢＭＣ增殖，⑥结果分析。它是一种开创性的人胎盘组织液抗炎作用检测方法，它对人胎盘组织液抗炎药的研发与生产奠定了科学基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及-种检测方法，尤其是。技术背景人们都知道人胎盘组织液具有抗炎作用，但是，具体多大浓度的人胎盘组织 液才具有治疗效果，人们并不清楚，同时，目前人们还没有掌握人胎盘组织液抗 炎作用的检测方法，这样，就影响了这种生物药品的研发和生产。因此，研究一 种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，是目前需要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供。 本专利技术解决其技术问题的技术方案是，其工艺歩骤为①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养， ELISA检测TNF-a及 IFN-Y，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。2、根据权利要求1所述的，其特征在于 所述的人胎盘组织试验液的配制歩骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全培养 液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液。所述的hPBMC制备歩骤，即在无菌条件下，预置10mlFicoll分离液于50ml 离心管中。取正常成人供者血液20ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周 血稀释，将60ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30mlFico11分离 液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下，2000rpm离心20min， 小心收集界面单个核细胞层至50ml离心管中，加入PBS至20ml， 1500rpm离心 10min，洗涤2次，并作细胞计数，以完全培养基(RPMI1640+10。/。FBS+P/。双抗)重 悬细胞至2X107ml。所述的组织培养液与hPBMC共培养步骤，即50WhPBMC(2X 10Vml)和50WraA 混合接种于96孔平底板，然后向其中加入不同浓度的人胎盘组织试验液， 每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种于96孔平底 板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37"C， 5%C02，饱和湿度的细胞培养箱 中孵育72h。所述的空白对照组为50PiraA与150WLRPMI1640完全培养液的混合 物，所述的阴性对照组为5(MhPBMC(2Xl(f/ml)与150plRPMI1640完全培养液的 混合物，所述的阳性对照组为50WhPBMC(2X106/ml)、 50WPHA和100plRPMI1640完全培养液的混合物。所述的ELTSA检测TNF-a及IFN_ Y歩骤，即将经72h培养后的96孔板取出，1500rpm离心10min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0. 5mlEP管中，稀释，分 别用人TFN-yELISA试剂盒、人TNF-aELISA试剂盒检测IFN，及TNF-a含量。所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20|al上 清，加入20plMTT，在细胞培养箱巾继续培养4h， 1500rpm离心10min，吸弃培 养液上清后每孔加入15(V1DMS0，微量振荡器振荡10min后用酶标仪于599nm检所述的结果分析步骤，即釆用SPSS13. 0软件、GraphPadPrism5Demo软件进行 统计学分析。本专利技术的有益效果是；本专利技术开创了，它对人胎盘组织液抗炎 药的研发与生产奠定了科学基础。本专利技术的目的实验研究使用不同浓度的胎盘组织液，在体外对丝裂原激活 人外周血单核细胞(hPBMC)增殖以及分泌炎症因子的抑制作用。本专利技术的理论依据使用不同浓度的人胎盘组织液，与丝裂原激活的hPBMC 共培养，经37。C培养箱培养72h后，用ELISA试剂盒检测各组IFN-Y、 TNF-a的 水平，用MTT法检测hPBLC增殖情况。本专利技术试验的结果在raA的刺激作用下，hPBMC表达释放大量IFN-Y、TNF-a。 然而，在不同浓度的人胎盘组织液中进行培养时，炎性因子的分泌均受到不同程 度的抑制，并且在本试验范围内，人胎盘组织液对上述炎性因子分泌的抑制作用 呈现良好的剂量相关性，其中，当人胎盘组织液浓度较高时，对IFNi、 TNF-a 炎性因子分泌的抑制率高达90%以上。MTT试验还发现，不同浓度的组织液也都 具有抑制hPBMC增殖的作用(P<0. 01)。本专利技术实验的结论人胎盘组织液可明显抑制丝裂原刺激的hPBMC增殖以及 分泌IFN，及TNF-a的作用，并且抑制作用与人胎盘组织液呈现良好的剂量相关 性。具休实施方式，其工艺步骤为①人胎盘组织试验液 的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-a及 IFN-y，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。所述的人胎盘组织试验液的配制步骤为人胎盘组织原液及用RPMI1640完全 培养液2倍、4倍、6倍的进行稀释，即得人胎盘组织试验液。所述的hPBMC制备步骤，即在无菌条件下，预置10mlFicoll分离液于50ml 离心管中。取正常成人供者血液20ml，以1:2的比例用平衡至室温的PBS将外周 血稀释，将60ml稀释的外周血沿45度倾斜的管壁缓慢加至盛有30mlFico11分离液的离心管中，在关闭Heraeus离心机机械制动功能前提下，2000rpm离心 20min，小心收集界面单个核细胞层至50ml离心管中，加入PBS至20ml， 1500rpm 离心10min，洗涤2次，并作细胞计数，以完全培养基(RPMI1640+10。/。FBS+lQ/o双 抗)重悬细胞至2xl07ml。所述的组织培养液与hPBMC共培养步骤，，即50i!lhP丽C(2xl07ml)和 5(V1PHA混合接种于96孔平底板，然后向其中加入100pl不同浓度的人胎盘组 织试验液，每组设5个复孔；同时将空白对照组、阴性对照组和阳性对照组接种 于96孔平底板，每组设5个复孔，将96孔培养板置于37。C， 5%C02，饱和湿度 的细胞培养箱中孵育72h，所述的空白对照组为50jalPHA与15(^1RPMI1640完全 培养液的混合物，所述的阴性对照组为50lalhP丽C(2xl0Vml)与150plRPMI1640 完全培养液的混合物，所述的阳性对照组为50jilhPBMC(2xl07ml)、 50plPHA和 100plRPMn640完全培养液的混合物。所述的ELISA检测TNF-ct及IFN，步骤，即将经72h培养后的96孔板取出， 1500rpm离心10min，吸取hPBMC细胞培养液上清置于0. 5mlEP管中，稀释，分 别用人IFN，ELISA试剂盒、人TNF-aELISA试剂盒检测IFN-y及TNF-a含量。所述的MTT检测hPBMC增殖步骤，即从培养的hPBMC细胞每孔吸出20^1上 清，加入20nlMTT，在细胞培养箱中继续培养4h， 1500rpm离心10min，吸弃培 养液上清后每孔加入150[ilDMS0，微量振荡器振荡10min后用酶标仪于599nm检、 所述的结果分析步骤，即采用SPSS13. 0软件、GraphPadPrism5Demo软件进行 统计学分析。权利要求1、，其特征在于其工艺步骤为①人胎盘组织试验液的配制，②hPBMC制备，③组织培养液与hPBMC共培养，④ELISA检测TNF-α及IFN-γ，⑤MTT检测hPBMC增殖，⑥结果分析。2、 根据权利要求1所述的，其特征在 于所述的人胎盘组织试验液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胎盘组织液抗炎作用检测方法，其特征在于：其工艺步骤为：①人胎盘组织试验液的配制，②ｈＰＢＭＣ制备，③组织培养液与ｈＰＢＭＣ共培养，④ＥＬＩＳＡ检测ＴＮＦ－α及ＩＦＮ－γ，⑤ＭＴＴ检测ｈＰＢＭＣ增殖，⑥结果分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴广印，
申请(专利权)人：吴广印，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]