一种检测槟榔中特异性N-亚硝基化合物的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测槟榔中特异性N

【技术实现步骤摘要】
一种检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法


[0001]本专利技术涉及食品分析领域，具体涉及一种检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法。

技术介绍

[0002]槟榔碱是槟榔中生物碱含量最高的活性物质。2020年《柳叶刀》将槟榔碱定为2B致癌物，槟榔碱被认定为槟榔疑似致癌的关键活性成分。而槟榔生物碱中含有仲胺和叔胺，在咀嚼槟榔时，通过硫氰酸盐作为亚硝化催化剂与亚硝酸盐反应，在唾液中进行亚硝化反应，生成多种槟榔特有的复杂N
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亚硝基化合物，目前已知的有N
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亚硝基去甲槟榔碱(N
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nitrosoguvacoline，NGL)、N
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亚硝基去甲槟榔次碱(N
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nitrosoguvacine，NGC)、N
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亚硝基异丙酸(N
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nitrosonipecoticacid，NNIP)、3
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甲基亚硝胺丙腈(3
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methylnitrosaminopropionitrile，MNPN)和3
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甲基亚硝胺丙醛(3
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methylnitrosaminopropionaldehyde，MNPA)。这五种N
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亚硝基化合物可以通过氧化应激与细胞内其他大分子相互作用，从而促进口腔癌变。N
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亚硝基化合物的仪器检测方法主要有气相色谱
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热能分析仪法(Gaschromatography
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thermalanalyzer，GC
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TEA)、气相色谱
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质谱联用(Gaschromatography
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massspectrometry，GC
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MS)和液相色谱
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串联质谱(Liquidchromatographytandemmassspectrometry，LC
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MS/MS)。但GC
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TEA的专用性太强，而且价格昂贵，一般实验室和检测中心很难配备；而GC
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MS的分析检测时间较长。而液相色谱除了可以检测挥发性N
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亚硝基化合物之外，也可以分析非挥发性N
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亚硝基化合物；液相色谱结合质谱检测器能够在短时间内提供大量信息，而且其灵敏度和可重现性高，是检测N
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亚硝基化合物的理想方法。但关于槟榔生物碱在口腔中亚硝化可能生成的N
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亚硝基去甲槟榔次碱、N
‑
亚硝基去甲槟榔碱、3
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甲基亚硝胺丙腈、3
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甲基亚硝胺丙醛和N
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亚硝基异丙酸这五种N
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亚硝基化合物仍未见有LC
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MS/MS方法的建立。因此N
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亚硝基去甲槟榔次碱、N
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亚硝基去甲槟榔碱、3
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甲基亚硝胺丙腈、3
‑
甲基亚硝胺丙醛和N
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亚硝基异丙酸的LC
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MS/MS方法开发十分迫切，可以为槟榔碱疑似致癌性的机制研究提供有效的检测方法参考。

技术实现思路

[0003]要解决的技术问题：本专利技术提供了一种检测槟榔中特异性N
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亚硝基化合物的方法，该检测方法具有灵敏度高、分析时间短、定量准确的优点，可以应用于槟榔致癌性的研究，尤其适用于含N
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亚硝基去甲槟榔次碱、N
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亚硝基去甲槟榔碱、3
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甲基亚硝胺丙腈、3
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甲基亚硝胺丙醛和N
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亚硝基异丙酸的槟榔的致癌性研究。
[0004]技术方案：一种检测槟榔中特异性N
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亚硝基化合物的方法，所述N
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亚硝基化合物为N
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亚硝基去甲槟榔碱、N
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亚硝基去甲槟榔次碱、N
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亚硝基异丙酸、3
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甲基亚硝胺丙腈和3
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甲基亚硝胺丙醛。进一步的，采用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC
‑
MS/MS)进行检测，检测条件如
下：(1)液相色谱条件：色谱柱：WatersAcquityUPLCHSST3色谱柱，2.1mm
×
100mm，1.7μm；流动相：A：乙腈，B：0.1vt.％甲酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0.00～0.50min，5vt.％A；0.50～3.50min，5～95vt.％A；3.50～4.00min，95vt.％A；4.00～4.50min，95～5vt.％A；4.50～5.00min，5vt.％A；柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样量：2μL；流速：0.3mL/min；(2)质谱条件：质谱仪：三重四极杆质谱仪；离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.50kV；脱溶剂气
‑
氮气温度：350℃；脱溶剂气流量：1000L/h；雾化器压力：6.2bar；锥孔气流量：150L/h；扫描方式：多反应检测模式；质谱(MRM)参数：质谱(MRM)参数：表注：*为定量离子；3
‑
甲基亚硝胺丙醛+2,4
‑
二硝基苯肼为3
‑
甲基亚硝胺丙醛衍生反应的反应产物。进一步的，上述检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理：将3
‑
甲基亚硝胺丙醛进行柱前衍生，衍生方法如下：取含3
‑
甲基亚硝胺丙醛的样品液或标准溶液，加入同等体积的2,4
‑
二硝基苯肼反应溶液，充分混匀反应，静置；(2)制备标准工作曲线：用甲醇将标准品储备液分别稀释成五个浓度梯度的N
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亚硝基去甲槟榔碱、N
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亚硝基去甲槟榔次碱、3
‑
甲基亚硝胺丙腈和N
‑
亚硝基异丙酸混合标准溶液和3
‑
甲基亚硝胺丙醛+2,4
‑
二硝基苯肼标准溶液，再经0.22μm尼龙滤膜过滤；(3)采用LC
‑
MS/MS进行分析，统计各个浓度下各物质的峰面积，以标准溶液的浓度
为横坐标，定量离子的色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，得到线性回归方程和拟合优度R2。进一步的，所述流动相B的配制方法为：取1.0mL色谱级甲酸，加超纯水定容至1000mL，即获得0.1vt.％甲酸水溶液，流动相使用前均需超声处理10min。进一步的，所述步骤(1)中2,4
‑
二硝基苯肼反应溶液的配制方法如下：量取20mL纯乙腈，加入0.4mL纯甲酸，制成含2vt.％甲酸的乙腈溶液；称取2,4
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二硝基苯肼793mg，加入2m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法，其特征在于：所述N
‑
亚硝基化合物为N
‑
亚硝基去甲槟榔碱、N
‑
亚硝基去甲槟榔次碱、N
‑
亚硝基异丙酸、3
‑
甲基亚硝胺丙腈和3
‑
甲基亚硝胺丙醛。2.根据权利要求1所述的一种检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法，其特征在于：采用超高效液相色谱质谱联用仪UPLC
‑
MS/MS进行检测，检测条件如下：(1)液相色谱条件：色谱柱：WatersAcquity UPLC HSS T3色谱柱，2.1mm
×
100mm，1.7μm；流动相：A：乙腈，B：0.1vt.％甲酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0.00～0.50min，5vt.％A；0.50～3.50min，5～95vt.％A；3.50～4.00min，95vt.％A；4.00～4.50min，95～5vt.％A；4.50～5.00min，5vt.％A；柱温：30℃；样品室温度：10℃；进样量：2μL；流速：0.3mL/min；(2)质谱条件：质谱仪：三重四极杆质谱仪；离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：1.50kV；脱溶剂气
‑
氮气温度：350℃；脱溶剂气流量：1000L/h；雾化器压力：6.2bar；锥孔气流量：150L/h；扫描方式：多反应检测模式；质谱(MRM)参数：质谱(MRM)参数：3.根据权利要求1所述的一种检测槟榔中特异性N
‑
亚硝基化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)样品前处理：将3
‑
甲基亚硝胺丙醛进行柱前衍生，衍生方法如下：取含3
‑
甲基亚硝胺丙醛的样品液或标准溶液，加入同等体积的2,4
‑
二硝基苯肼反应溶液，充分混匀反应，静置；
(2)制备标准工作曲线：用甲醇将标准品储备液分别稀释成五个浓度梯度的N
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亚硝基去甲槟榔碱、N
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亚硝基去甲槟榔次碱、3
‑
甲基亚硝胺丙腈和N
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亚硝基异丙酸混合标准溶液和3
‑
甲基亚硝胺丙醛+2,4
‑
二硝基苯肼标准溶液，再经0.22μm尼龙滤膜过滤；(3)采用LC
‑
MS/MS进行分析，统计各个浓度下各物质的峰面积，以标准溶液的浓度为横...

【专利技术属性】
技术研发人员：马玲君，李晓慧，季俊夫，胡小松，陈芳，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：