一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒，本发明专利技术提供的引物组提供了多个靶标，可高灵敏度地检测临床常见和高发微生物造成的侵袭性感染。本发明专利技术还提供了一种试剂盒，包含引物组和PCR缓冲液，两者组合能进一步提高检出限，并减少了后续测序检测微生物时样本DNA的损失，提高了样本DNA的得率。了样本DNA的得率。了样本DNA的得率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，涉及一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒。

技术介绍

[0002]血流感染是败血症和感染性休克的主要病因，选择适当的抗菌剂能够应对血流感染带来的危害，随着微生物对抗菌剂的耐药性日益增加，目前采用在实验室条件下对采集到的样本进行血培养(BC)的方式，通过鉴定阳性的致病性微生物来选择适当的抗菌剂，但该种方式耗时较高，且鉴定出的阳性准确率不高。
[0003]血培养是血流感染病原检测的金标准，但具有细菌生长缓慢、周期长、营养要求高、细胞内生长、血培养阳性率低等明显的缺陷。以荧光qPCR技术为代表的分子诊断技术的出现，在一定程度上解决了血培养的问题，但也存在诸如不能提供病原的基因序列，以及通量低的问题。宏基因组测序(mNGS)解决了病原检测通量的短板，但宿主核酸比例高、检测敏感度低、周期长和成本高等问题仍待解决。针对以上技术限制，亟需开发一种新的针对血流感染的检测方法。
[0004]多重PCR靶向高通量测序是一种潜在可以替代或解决以上血液病原感染的检测问题的方法，此方法具有成本低、时效短、准确率高等优点，但因为多重PCR扩增的单个反应中，引物的数量往往达到几百甚至几千条，技术难度高；同时病原微生物序列相似度高，进一步加大了多重PCR建库的难度。近年也有报导利用多重PCR建库试剂盒进行病原微生物的检测，但大多只针对某一种类型样本的部分病原进行检测。除此之外，现有的病原微生物多重PCR法文库构建试剂盒因为在同一反应管中存在几百甚至几千条引物，而整个试剂盒的引物组及反应体系为整体分析优化的结果，因此，现有的病原微生物多重PCR建库试剂盒还存在以下的常见问题：(1)引物间相互干扰，形成大量二聚体，降低试剂盒性能；(2)非特异扩增，产生大量非目标扩增子，影响后续测序；(3)无法进行准确的定量；(4)扩增均一性无法保障；(5)扩展性、灵活性差。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供一种基于多重扩增的多靶标高通量测序检测血流感染的引物组、试剂盒及方法，本专利技术基于多重PCR引物组，配合特定组分的缓冲液，以及血液样本预处理酶制剂，拟解决解决血培养技术周期长、分辨率低和耗费人力的缺点和新型分子生物学检测技术存在的通量不高、灵敏度不足、特异性差的问题。
[0006]基于上述目的，本专利技术提供了一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒用于解决本领域内的该技术问题。
[0007]一方面，本专利技术涉及一种用于血流感染多靶标检测的试剂盒，检测样本为血液，其包括引物组，所述引物组包括分别针对高发微生物大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、布鲁菌、沙门菌属、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠
菌、B群链球菌的引物对；
[0008]分别针对耐药基因mecA、mecC、tetK、CRKP、OXA
‑
51的引物对；
[0009]分别针对毒力基因PVL、asal的引物对；
[0010]用于内参的引物对；
[0011]针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0013]针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0014]针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
[0015]针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
[0016]针对布鲁菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对布鲁菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
[0017]针对沙门菌属的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对沙门菌属的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
[0018]针对肺炎链球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对肺炎链球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
[0019]针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
[0020]针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
[0021]针对B群链球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，针对B群链球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
[0022]针对mecA的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，针对mecA的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
[0023]针对mecC的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，针对mecC的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
[0024]针对tetK的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，针对tetK的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
[0025]针对CRKP的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，针对CRKP的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
[0026]针对OXA
‑
51的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，针对OXA
‑
51的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
[0027]针对PVL的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，针对PVL的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
[0028]针对asal的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，针对asal的反向引物的
核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
[0029]用于内参的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示，用于内参的引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0030]进一步地，本专利技术提供的用于血流感染多靶标检测的试剂盒中，还包括缓冲液，所述缓冲液包括：β
‑
巯基乙醇、四氢甲基嘧啶羧酸、PCR预混液、PCR酶液；
[0031]所述PCR预混液包括10
×
PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs；
[0032]所述PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血流感染多靶标检测的试剂盒，检测样本为血液，其特征在于，包括引物组，所述引物组包括分别针对高发微生物大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、布鲁菌、沙门菌属、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、B群链球菌的引物对；分别针对耐药基因mecA、mecC、tetK、CRKP、OXA
‑
51的引物对；分别针对毒力基因PVL、asal的引物对；用于内参的引物对；针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；针对布鲁菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对布鲁菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；针对沙门菌属的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对沙门菌属的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；针对肺炎链球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对肺炎链球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No....

【专利技术属性】
技术研发人员：夏涵，杨启文，官远林，张烨，李长诚，佟斯垚，张栋，喻玮，朱盈，贾沛瑶，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：