食品中大豆异黄酮总量的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，实现了样品中各类大豆异黄酮苷到相应苷元的定量转化；通过应用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法，实现了样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期，方法学研究表明，本方法具有较低的检出限及较高的准确度。由于本发明专利技术仅通过3种大豆异黄酮苷元就实现了样品中12种大豆异黄酮总量的测定，标准品的使用费用在原先需要最少使用6种异黄酮标准品的基础上减少为仅为原来的1/3。此外，总大豆异黄酮以苷元计，一方面能更准确地体现实际生物活性水平，另一方面也可以避免因使用苷或苷元的不统一而造成总异黄酮结果表述的不一致。一致。一致。

【技术实现步骤摘要】
食品中大豆异黄酮总量的测定方法


[0001]本专利技术属于分析检测
，具体涉及含大豆蛋白类食品中大豆异黄酮总量的测定。

技术介绍

[0002]大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，其结构与雌激素相似，因而在体内吸收后可与雌激素受体结合并产生雌激素样活性。正是由于具有类雌激素作用，大豆异黄酮又被称为植物雌激素，并用于改善更年期综合症。此外，有研究表明，大豆异黄酮具有抗氧化、预防肥胖、预防糖尿病、降低癌症风险、降低血糖及防止骨质酥松的作用，因而在保健品行业被广泛推广。但是过量摄入大豆异黄酮也会带来负面影响，特别是对于使用豆基配方食品的婴儿。
[0003]作为GB 10765
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2021(食品安全国家标准婴儿配方食品)豆基婴儿配方食品中允许的并且是唯一的主要蛋白质来源，大豆来源的大豆分离蛋白往往残留有一定量的大豆异黄酮。由于缺少相关数据，以往认为使用豆基婴儿配方食品是安全的，然而，近年来最新的研究表明，当婴儿在发育敏感窗口期暴露在一定浓度水平的大豆异黄酮下，其产生的雌激素样作用将对生殖系统发育产生不良影响，并具有成年后引发相关疾病的风险。考虑到大豆及其制品在中国及其它亚洲国家有着普遍的食用习惯，同时由于大豆分离蛋白作为可替代动物蛋白的少数植物蛋白而被广泛用于食品工业及膳食补充剂，因此过量摄入植物雌激素的风险与日俱增，而准确快速的测定食品中大豆异黄酮含量不但为消费者提供合理的饮食指导，而且能促进大豆深加工产业链的发展。低异黄酮残留的大豆分离蛋白也将进一步保障豆基婴儿配方食品的使用安全性。/>[0004]大豆异黄酮可以分为两类：一类为游离型苷元，包括大豆苷元、黄豆黄素、染料木素；另一类为结合型，苷元分别结合葡萄糖基、葡萄糖乙酰基及葡萄糖丙二酰基。以上游离型和结合型共计12种，其中结合型在大豆中约占总异黄酮的97％
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98％。由于乙酰类及丙二酰类异黄酮苷稳定性差，故难以获取相应的标准品，进而造成了该类异黄酮定量的困难。因此，多数方法仅检测其中的3种苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)及3种苷(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷)，从而无法真实反映样品中实际大豆异黄酮的含量水平。
[0005]美国分析化学家协会(AOAC)和美国药典(USP)收载的大豆异黄酮测定方法均采用了标准图谱比对法，并通过引入“转换因子”的方式以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷为标准品对乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行定量检测，但是采用上述方法需要确保色谱条件的充分一致性，包括色谱柱的规格、品牌的选择，以保证获得相对一致的保留时间，当样品基质复杂时往往引起较大的结果偏差。其它方法如AOAC 2001.10通过皂化的方式将乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行水解，以此获得相应的大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷，并用六个标准品进行定量。该方法能比较准确地测定异黄酮的总量，但对含量较低的样品其测定偏差较大。
[0006]目前国内标准方法有GB/T 23788
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2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效
液相色谱法》及QB/T 5397
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2019《大豆食品中异黄酮含量的测定》，两种方法均以高效液相色谱结合紫外检测的方式测定样品中3种苷元(大豆苷元、大豆黄素、染料木素)和3种苷(大豆苷、黄豆苷、染料木苷)。由于普遍采用甲醇水等极性混合溶剂通过振荡或超声的方式进行提取，同时也由于缺乏乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷标准品，这就造成无法对另外6类主要异黄酮进行有效测定，从而使测定结果较真实结果偏低。
[0007]鉴于以上方法的局限性及不准确性，有必要开发并建立一种能真实反映样品中大豆异黄酮含量水平的测定方法，并具备准确、简便、快速的特点。
[0008]基于上述研究，本专利技术旨在实现大豆类相关食品中总异黄酮的准确测定，为食品发展及食品安全监管提供有力的技术支撑。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，可以实现样品中的各类异黄酮苷定量转化为相应的苷元；超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的运用可以实现样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期。
[0010]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0011]一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，包括以下步骤：
[0012]S1、待测样品使用碱性甲醇溶液进行提取处理，得提取液；
[0013]S2、所述提取液中加入β
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葡萄糖苷酶进行酶解，实现转化后加入纯甲醇混合溶解，得测试液；
[0014]S3、所述测试溶液经超高效液相色谱
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串联三重四级杆质谱进行检测，获得待测样品中异黄酮类化合物的含量，所述异黄酮类化合物包括大豆苷元、黄豆黄素及染料木素。
[0015]本申请测定方法的原理为：待测样品(本申请中也称作试样)经碱性甲醇溶液提取，提取过程中试样中丙二酰及乙酰类大豆异黄酮苷分子上的酰基被水解，并转变为相应的异黄酮苷(大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷)，提取液在酸性缓冲溶液中经β
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葡萄糖苷酶酶解，各类异黄酮苷分子上的葡萄糖基被水解去除，溶液中所有的异黄酮苷均转变为相应的苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)；酶解液用纯甲醇混合并稀释后经反相色谱柱分离，高效液相色谱串联质谱检测，以外标法定量。
[0016]可选的，在一种实施方式中，步骤S1中，所述碱性甲醇溶液为含有3g/L氢氧化钠的80％甲醇水溶液。
[0017]可选的，在一种实施方式中，所述提取处理包括，在含总大豆异黄酮50
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500ug的待测样品中加入80mL碱性甲醇溶液，超声提取20min，加入4mL冰醋酸中和后用80％甲醇溶液定容至100mL。
[0018]可选的，在一种实施方式中，步骤S1中，所述待测样品中异黄酮总量的范围以苷元计为50ug
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500μg。
[0019]可选的，在一种实施方式中，步骤S2具体包括，所述提取液1体积当量与4体积当量含5个活性单位葡萄糖苷酶的醋酸缓冲液混匀，在50℃水浴条件下振摇酶解120min，冷却，用甲醇定容至10体积当量。
[0020]进一步可选的，在一种实施方式中，步骤S2中，所述醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/
L,pH＝5.0。
[0021]可选的，在一种实施方式中，步骤S2中，所述酶解样品溶液用0.2μm的聚丙烯(PP)滤头过滤后备用。
[0022]可选的，在一种实施方式中，步骤S3中，所述超高效液相色谱
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串联三重四级杆质谱中的液相色谱的检测条件包括：
[0023]色谱柱：C18柱，50mm
×
2.1mm，1.8μm，或等效亚2微米超高效色谱柱。
[0024]可选的，在一种实施方式中，液相色谱的其他检测条件还包括：
[0025]流动相：A相，0.1％(v/v)甲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、待测样品使用碱性甲醇溶液进行提取处理，得提取液；S2、所述提取液中加入β
‑
葡萄糖苷酶进行酶解，实现转化后加入纯甲醇混合溶解，得测试液；S3、所述测试液经超高效液相色谱
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串联三重四级杆质谱进行检测，获得待测样品中异黄酮类化合物的含量，所述异黄酮类化合物包括大豆苷元、黄豆黄素及染料木素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述碱性甲醇溶液为含有3g/L氢氧化钠的80％甲醇水溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述提取处理包括：含总大豆异黄酮50
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500ug的待测样品，加入80mL碱性甲醇溶液，超声提取20分钟后，加入4mL冰醋酸并用80％甲醇溶液定容至100mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述待测样品中异黄酮总量以苷元计为50
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500μg。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2具体包括，所述提取液1体积当量与4体积当量含5个活性单位葡萄糖苷酶的醋酸缓冲液混匀，在50℃水浴条件下振摇酶解120min，冷却，用纯甲醇定容至10体积当量。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH＝5.0。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晓芳，顾文，庞月红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：