一种抗虫蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新抗虫蛋白的制备方法及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术提供了一种新抗虫蛋白及其编码基因，新蛋白为抗虫突变蛋白，该抗虫突变蛋白为Cry1Ie4蛋白在第174位、第209位和第260位发生了突变的蛋白。所述应用是编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用，在制备抗虫突变蛋白中的应用，以及抗虫突变蛋白在制备杀虫剂中的应用。本发明专利技术通过对Cry1Ie4蛋白的人工改造，提高了它的活性。提高了它的活性。提高了它的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种抗虫蛋白及其制备方法和应用，具体为改造的Cry1Ie4蛋白。

技术介绍

[0002]目前，商业化的转基因抗虫玉米中，含有Cry1Ab蛋白（例如MON810、DBN9936）的玉米具有很好的玉米螟控制效果。然而，随着转基因抗虫玉米产业化种植规模逐步扩大，国外已有报道玉米螟对Cry1Ab玉米产生了抗性，而我国的转基因玉米商业化的政策也在逐步开放。为了提前做好玉米螟的抗性管理，开发不具Cry1A类交互抗性的抗虫玉米是有效的管理手段之一。已有研究表明，Cry1I类与Cry1Ab没有交互抗性，替换或者与该蛋白进行叠加，可以延缓玉米螟抗药性的产生（Xu L, Wang Z, Zhang J, et al. Cross
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resistance of Cry1Ab
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selected Asian corn borer to other Cry toxins[J]. Journal of Applied Entomology, 2010, 134(5): 429
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438.）。
[0003]在已经鉴定到的Cry类Bt抗虫基因（苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis基因，简称Bt基因）中，Cry1I类蛋白具有独特性，它们具有类似于Cry和VIP两者的生物化学特性，其在苏云金芽孢杆菌菌株中通常是沉默基因，在大肠杆菌培养中可以以大约81 kDa的原毒素形式表达，这是Cry1类蛋白中独一无二的分子质量。此外，Cry1I类蛋白的靶标昆虫种类包括鳞翅目和鞘翅目，且与Cry1A类蛋白不会产生交互抗性。因此，Cry1I类基因的研究具有更为重要的理论意义和实用价值，并将为解决 Bt 毒素杀虫谱较窄、害虫抗药性产生等问题提供新的基因选择。
[0004]据报道称，Cry1Ie4对小菜蛾和玉米螟具有杀虫活性（K
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S
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桑普森，D
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J
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汤姆索，R
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V
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杜米特鲁.杀虫蛋白和使用它们的方法：CN201080018183.X[P]. CN102421905B），但经过实验室测试发现Cry1Ie4对玉米螟的杀虫活性远低于Cry1Ab，因此利用Cry1Ie4开发转基因玉米难以达到商业化种植的要求。本项目为了获得与Cry1Ab没有交互抗性的新蛋白，通过对杀虫蛋白Cry1Ie4毒性区的改造从而增强其杀虫活性，并投入抗虫玉米开发，将具有很好的应用前景。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对Cry1Ie4蛋白的进行点突变，提高了其杀虫活性，拓展了其应用范围。
[0006]专利技术人发现Cry1Ie4对玉米螟的活性并不显著，而对杀虫蛋白毒性区的改造能够增强蛋白的杀虫活性。因此，本专利技术通过改造Cry1Ie4蛋白获得更佳的玉米螟杀虫活性并应用于抗虫玉米的开发，其具有很好的应用前景。
[0007]首先，专利技术人通过连续易错PCR方法对编码Cry1Ie1蛋白的核酸分子进行突变，并将突变子表达蛋白，然后通过玉米螟生测试验筛选出了有更高杀虫活性的突变蛋白，分析编码蛋白的核苷酸序列，找到了突变位点。因为同属于Cry1Ie类蛋白，在上述研究的基础
上，本专利技术在Cry1Ie4中找到同源的活性位点并进行突变，然后通过玉米螟生测筛选出了优于Cry1Ie4的6种重组蛋白。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个方面是提供一种抗虫突变蛋白，其为改造的Cry1Ie4蛋白；其中，所述改造的Cry1Ie4蛋白含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列且在以下位点中进行突变：第174位、第209位和第260位。
[0009]在一个实施方式中，所述第174位氨基酸突变为非K的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，E，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为G；所述第209位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，D，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为K；所述第260位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，E，F，W，Y，N，S，Q，K，M，T，C，P，H，R，I；优选地，突变为N。
[0010]进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白具有的突变位点还包括：第126位，第140位；更进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白具有的突变蛋白组合为：1）D140S+K174G+E209K+D260N；2）S126N+D140S+K174G+E209K+D260N。
[0011]进一步地，所述改造的Cry1Ie4蛋白1）K174G+E209K+D260N，2）D140S+K174G+E209K+D260N；3）S126N+D140S+K174G+E209K+D260N的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 3、5、7所示。
[0012]本专利技术的第二个方面是提供一种用于编码任一上述的抗虫蛋白的核酸分子，其中，编码所述SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013]进一步地，编码所述SEQ ID No.3、5、7所示的氨基酸序列的核酸序列分别如SEQ ID No. 4、6、8所示；上述涉及的氨基酸及核酸序列如下表1所示：表1
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抗虫蛋白相关的序列信息
[0014]本专利技术的第三个方面是提供一种与任一上述的抗虫蛋白或与任一上述的核酸分子相关的生物材料，其包括含有如任一上述的核酸分子的重组载体、重组微生物、重组细胞系。
[0015]进一步地，所述重组载体为pET28a表达载体，其也可替换为本领域常规使用的合适的其他表达载体。
[0016]进一步地，所述重组细胞系为大肠杆菌BL21细胞系，也可采用合适的其他菌株类
型的原核表达细胞系。
[0017]本专利技术的第四个方面是提供一种任一上述的抗虫蛋白的制备方法，其包括步骤：在编码Cry1Ie4蛋白的如SEQ ID NO. 2所述的核酸序列上，根据对应的突变位点通过同源重组的方法对其核酸序列进行改造，再将突变后的核酸分子构建到pET28a表达载体中，并转入大肠杆菌BL21细胞系，进行改造的Cry1Ie4蛋白表达。
[0018]进一步地，在设计编码Cry1Ie4蛋白的核酸序列时，其密码子设置为大肠杆菌（K12菌株）偏好性，并避免XhoI和HindIII酶切位点进行人工合成；将突变后的核酸分子克隆到pET28a表达载体中限制性内切酶XhoI和HindIII的位点之间，获得蛋白表达载体。
[0019]进一步地，大肠杆菌BL21细胞系中蛋白表达的具体步骤包括：单个菌落接种到LB液体培养基，培养至培养基浑浊，取菌液加入 IPTG（Isopropyl
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β...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗虫突变蛋白，其特征在于，所述抗虫突变蛋白为SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列蛋白的以下氨基酸位点处存在突变：第174位氨基酸突变为G、第209位氨基酸突变为K、第260位氨基酸突变为N。2.根据权利要求1所述的抗虫突变蛋白，其特征在于，所述抗虫突变蛋白还包括如下任意一种：1）SEQ ID NO. 1第140位的D突变为S，第174位的K突变为G，第209位的E突变为K，且第260位的D突变为N所得到的蛋白；2）SEQ ID NO. 1第126位的S突变为N，第140位的D突变为S，第174位的K突变为G，第209位的E突变为K，且第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉静，王营，左丹，旷乐，王晖，李晨，
申请(专利权)人：莱肯生物科技海南有限公司，
类型：发明
国别省市：