一种来源于高山被孢霉的C制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于高山被孢霉的C

【技术实现步骤摘要】
一种来源于高山被孢霉的C
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延长酶及其应用


[0001]本专利技术涉及一种C
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脂肪酸延长酶及其在脂质合成中的应用，属于基因工程和微生物工程


技术介绍

[0002]微生物油脂是一种由微生物生产的脂类，其成分类似于传统的植物和动物油脂。微生物油脂是一种具有广泛应用前景的新型生物质资源，具有很多优点，例如可再生性强、生产周期短、生产成本低等。微生物油脂可以克服了传统长链多不饱和脂肪酸(Long Chain Polyunsaturated fatty acids,LC
‑
PUFAs)来源不足的问题，因此被认为是植物油和鱼油的可行替代品。目前对微生物油脂的研究主要集中于生产高附加值的功能性长链多不饱和脂肪酸和特殊工业用油等，具备工业化开发和生产条件，对社会经济可持续发展具有促进作用，目前已经有部分菌株应用于商业化生产。随着微生物学和分子生物学的飞速发展，微生物油脂已经成为当前LC
‑
PUFAs领域的研究热点，通过基因工程技术对其脂肪酸合成路径改造和优化，达到以可持续方式生产所需LC
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PUFAs的目的。
[0003]微生物合成PUFAs，先经过脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)催化得到棕榈酸C16:0，再以棕榈酸为起始物，将两个碳单元加到脂肪链的羧基末端，形成长链脂肪酸。脂肪酸延长过程涉及到四步反应，先由丙二酰辅酶A与长链脂酰辅酶A在3
‑
酮脂酰
‑<br/>CoA合酶催化下缩合生成β
‑
酮酰辅酶A，其中酰基部分被两个碳原子拉长。形成的β
‑
酮酰基
‑
CoA然后被β
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酮酰辅酶A还原酶还原成β
‑
羟基酰基
‑
CoA，再由脱水酶脱水成烯基
‑
CoA，最后烯基还原酶还原得到拉长的酰基
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CoA。线粒体中的延长是独立于脂肪酸合成之外的过程，是乙酰单元的加成和还原，为脂肪酸降解过程的逆反应。已证实延长过程第一步的缩合反应是脂肪酸延长的限速步骤，将缩合酶称为“延长酶”。C
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延长酶是长链多不饱和脂肪酸合成第一步酶反应，在决定进入脂肪酸生物合成途径的总碳量方面起着重要的作用，其酶活将会限制更长链脂肪酸的产量。
[0004]C
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延长酶的鉴定比较少，秀丽隐线虫中对CeELO2进行RNAi干扰后，发现C16:0脂肪酸明显升高，CeELO2具有C
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延长酶活性。将小鼠的ELOVL6敲除后，小鼠体内C16:0、C16:1脂肪酸明显积累，证明ELOVL6参与C16到C18脂肪酸延长。酿酒酵母的ELO2被证明也会参与到C16:0脂肪酸的延长，但是这几种延长酶没有被应用。Katsuya将小鼠的rELO2在酿酒酵母中过表达之后，C18/C16脂肪酸的转化率从55.7％提升到83.5％，提高了0.58倍。将海洋微藻中延长酶NsFAE在酿酒酵母中过表达后，转化子C18/C16脂肪酸的转化率从43.42％提升到58.6％，提高了0.35倍。Eiji Sakuradani在2009年鉴定了高山被孢霉中C
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延长酶基因MALCE1，酵母转化子的C18/C16脂肪酸的转化率从40.6％提升到63.1％，提高了0.55倍。该延长酶已经广泛应用于微生物来源的LC
‑
PUFAs产量提高中，例如利用解脂耶氏酵母和海洋微藻高产二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)，解脂耶氏酵母高产油酸，提高裂殖壶菌中二十碳六烯酸(decosahexaenoic acid，DHA)含量等。综上所述，产油微生物的基因改造中C
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延长酶的应用广泛，所以对于更高转化率的C
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延长酶鉴定是有必要
的。
[0005]高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种具有很强的脂质合成能力，能从头合成包括花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)在内的多种功能性LC
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PUFAs的产油丝状真菌。高山被孢霉已实现商业化生产ARA，可用于代替或补充传统来源的LC
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PUFAs。高山被孢霉的延长酶经报道已经有三种被分离和表征功能，2000年，Jennifer M.Parker
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Barnes从高山被孢霉中分离到第一个延长酶GLELO基因，并通过在酿酒酵母中异源表达和底物添加，确定GLELO编码的蛋白质可以催化GLA(18:3，n6)到DGLA(20:3，n6)。2008年，Eiji Sakuradani从M.alpina 1S
‑
4分离得到延长酶基因MAELO，与野生菌株相比，通过RNA干扰获得的基因沉默菌株证实MAELO基因编码的酶参与了M.alpina 1S
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4中20
‑
、22
‑
和24
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碳饱和脂肪酸的生物合成。高山被孢霉中含有丰富的长链多不饱和脂肪酸，其中分离得到的延长酶和脱饱和酶被作为一种优势的元件应用到产油微生物改造中。C
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延长酶作为脂肪酸延长的第一个限速酶，决定了LC
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PUFAs的含量，所以更高活性的C
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延长酶的鉴定，具有十足的科研价值和应用前景。

技术实现思路

[0006][技术问题][0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可提高微生物C16脂肪酸延长为C18脂肪酸能力的C
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脂肪酸延长酶。
[0008][技术方案][0009]从高山被孢霉中提取RNA反转录得到cDNA，通过PCR技术对目的基因片段进行扩增，插入到酿酒酵母质粒pYES2
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NT C中，得到表达载体pYES2
‑
MaELO4，挑选阳性转化子并完成测序验证。随后利用醋酸锂法转入酿酒酵母中INVSc1，得到的重组菌株进行Westernblot候选MaELO4基因编码的蛋白表达量，并通过进行活性验证。本专利技术证实了筛选的MaELO序列具有C
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延长酶活性，并提供了该基因编码的酶在转化LC
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PUFAs方面的应用。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供C
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延长酶在催化长链多不饱和脂肪酸方面应用，所述应用为催化底物C16脂肪酸。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述C16脂肪酸包括C16:0和C16:1。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述C
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延长酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述C
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延长酶含有SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.C
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延长酶在催化合成长链多不饱和脂肪酸方面的应用，其特征在于，所述应用为催化底物C16脂肪酸，所述C
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延长酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C16脂肪酸包括C16:0和C16:1。3.C
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延长酶在制备顺式油酸中的应用，其特征在于，所述C
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延长酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。4.一种提高酵母中C18脂肪酸含量的方法，其特征在于，过表达C
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延长酶，所述C
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延长酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述C18脂肪酸包括C18:0、C18:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，王瑜鑫，常璐璐，杨波，陈卫，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：