一种脐血来源的内皮祖细胞及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种脐血来源的内皮祖细胞及其培养方法。所述培养方法包括：将脐血进行离心，收集上清液为脐血浆，沉淀为浓缩的脐血，将浓缩后的脐血离心分离得到单个核细胞，将所述单个核细胞接种于含有脐血浆和微载体的培养基中进行初次培养，初次培养结束后将微载体转移至搅拌器中搅拌培养。本发明专利技术通过在培养基中添加细胞生长因子和脐血血浆促进细胞生长，同时添加比表面积大的微载体，提高了单位体积培养液的细胞产率，简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好，培养基利用率高，并且也简化了细胞收获过程，劳动强度小，培养系统占地面积小，在体外获得了流式表型优的内皮祖细胞。祖细胞。祖细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种脐血来源的内皮祖细胞及其培养方法


[0001]本专利技术属于干细胞培养
，涉及一种脐血来源的内皮祖细胞及其培养方法。

技术介绍

[0002]内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPC)是一种能够增殖、迁移、粘附并具有分化为血管内皮细胞潜能的原始细胞。EPCs不仅参与胚胎血管生成，也参与出生后的血管新生、内皮损伤修复等过程。EPC存在于骨髓、外周血和脐带血中，脂肪组织和心肌中也存在EPC。研究发现，EPC对疾病诊断、预后判断和靶向治疗方面发挥重要作用，在冠状动脉粥样硬化性疾病、糖尿病血管病变、恶性肿瘤等治疗中全身或局部注射EPC具有更广泛的前景和应用价值。
[0003]脐带血(cordblood，CB)是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。脐带血不仅来源丰富、采集方便，同时具有病毒污染概率小、供体无风险、可快速获得等优点。随着临床上的广泛应用和科研工作者们对脐带血的深入研究，脐带血不仅仅被用于治疗血液系统疾病，也被广泛地用于各种免疫缺陷、代谢性疾病、神经系统疾病的治疗，以及用于开展再生医学领域的研究。研究表明，脐带血中含有多种类型干细胞，主要包括：造血干细胞(hemopoieticstemcell，HSCs)、间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)、内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)等。与成人外周血来源的EPC相比，脐带血来源的EPC细胞具有更强的分化能力和增殖能力。因此，脐带血是体外分离获得EPC细胞的最佳来源。
[0004]已知现有的脐带血EPC培养方式主要是先离心脐带血获得总有核细胞(TNC)，再用EPC培养液培养在纤维蛋白或胶原等包被的培养瓶中培养TNC，贴壁生长的细胞被认为是EPC，通过换液去除其他细胞和杂质，但是这种分离方法去除杂质的效果差，效率低，得到的内皮祖细胞数量少。
[0005]综上所述，目前培养内皮祖细胞(EPC)的方法操作过程复杂，价格较为昂贵，得到的细胞数量、活性等不理想，EPC无法在体外稳定的扩增繁殖(易老化、传代次数少、增殖数量少、细胞表面粘附分子表达低)，大大地限制了其在研究和临床应用的需求。如何提供一种便捷，高效，低成本的内皮祖细胞培养方法，已成为目前干细胞培养
亟待解决的问题之一。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种脐血来源的内皮祖细胞及其培养方法，解决了目前内皮祖细胞的培养方法获得的内皮祖细胞生物活性低，分化潜能无法保障，获取细胞数量少，表型差等问题，实现了便捷，低成本地大量扩增内皮祖细胞，获得的内皮祖细胞具有良好的流式表型，对免疫细胞治疗的发展有重要的意义。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种内皮祖细胞的培养方法，所述培养方法包括：
[0009]将脐血进行离心，收集上清液为脐血浆，沉淀为浓缩的脐血，将浓缩后的脐血离心分离得到单个核细胞，将所述单个核细胞接种于含有脐血浆和微载体的培养基中进行初次培养，初次培养结束后将微载体转移至搅拌器中搅拌培养。
[0010]本专利技术通过在培养基中添加细胞生长因子和脐血血浆促进细胞生长，同时添加比表面积大的微载体，提高了单位体积培养液的细胞产率，简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好，培养基利用率高，并且也简化了细胞收获过程，劳动强度小，培养系统占地面积小，在体外获得了流式表型优的内皮祖细胞。
[0011]优选的，所述培养基中微载体包括：液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体或磁性微载体中的任意一种或至少两种的组合。
[0012]使用微载体能够使细胞产量更高，更接近体内细胞一样的三维形态，有利于细胞间的通讯。
[0013]优选的，所述培养基中微载体的包被物包括：人纤维连接蛋白、胶原蛋白、甲基纤维素或透明质酸中的任意一种或至少两种的组合。
[0014]使用微载体包被物能够促进干细胞的多能生长。
[0015]优选的，所述培养基中微载体的浓度为1～5ng/mL。
[0016]上述1～5中的具体点值可以选择1、1.1、1.2、1.5、2、2.5、2.8、3、4.7、4.8、4.9、5等。
[0017]优选的，所述培养基中脐血浆的体积百分比为2
‑
10％。
[0018]上述2～10％中的具体点值可以选择2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
[0019]优选的，所述培养基中还包括细胞生长因子。
[0020]优选的，所述细胞生长因子包括VEGF、bFGF
‑
2、PD
‑
ECGF、FGF
‑
1、TNF
‑
β4或LIF中的任意一种或至少两种的组合。
[0021]优选的，所述初次培养的方法包括：
[0022]13～18r/min，培养1.5～2.5h，然后28～32r/min培养至第2天，补加培养基，再以45～55r/min进行培养。
[0023]上述13～18r/min中的具体点值可以选择13r/min、13.2r/min、13.4r/min、13.6r/min、14r/min、15r/min、16r/min、17r/min、17.7r/min、17.8r/min、17.9r/min、18r/min等。
[0024]上述1.5～2.5h中的具体点值可以选择1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2.0h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h、2.5h等。
[0025]上述28～32r/min中的具体点值可以选择28r/min、28.2r/min、28.4r/min、28.6r/min、29r/min、30r/min、31r/min、31.4r/min、31.7r/min、31.8r/min、31.9r/min、32r/min等。
[0026]优选的，所述补加培养基的量为原始培养基体积的1/10～1/5。
[0027]上述1/10～1/5中的具体点值可以选择1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5等。
[0028]优选的，所述搅拌培养的时间为2
‑
4天，搅拌速度为30
‑
70r/min。
[0029]搅拌的作用是使微载体悬浮，充分与培养基接触，高效地进行物质和能量交换，有
利于细胞生长。
[0030]上述2
‑
4天中的具体点值可以选择2.2天、2.4天、2.6天、2.8天、3天、3.4天、3.6、3.8天、4天等。
[0031]上述30
‑
70r/min中的具体点值可以选择30r/min、32r/min、34r/min、36r/min、38r/min、40r/min、50r/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：将脐血进行离心，收集上清液为脐血浆，沉淀为浓缩的脐血，将浓缩后的脐血离心分离得到单个核细胞，将所述单个核细胞接种于含有脐血浆和微载体的培养基中进行初次培养，初次培养结束后将微载体转移至搅拌器中搅拌培养。2.根据权利要求1所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基中微载体包括：液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体或磁性微载体中的任意一种或至少两种的组合；优选的，所述培养基中微载体的包被物包括：人纤维连接蛋白、胶原蛋白、甲基纤维素或透明质酸中的任意一种或至少两种的组合；优选的，所述培养基中微载体的浓度为1～5ng/mL。3.根据权利要求1或2所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基中脐血浆的体积百分比为2～10％。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基中还包括细胞生长因子；优选的，所述细胞生长因子包括VEGF、bFGF
‑
2、PD
‑
ECGF、FGF
‑
1、TNF
‑
β4或LIF中的任意一种或至少两种的组合。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，所述初...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏伟，李永生，
申请(专利权)人：广州市天河诺亚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：