一种脂肪间充质外泌体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质外泌体及其制备方法，属于肺损伤的用途技术领域，用25ml移液管吸取静置后分层的采集瓶中的脂肪样本中下层液体弃掉，再用25ml移液管吸取脂肪组织，每个离心管中加入等体积的脂肪组织每管加20

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质外泌体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种脂肪间充质外泌体，属于外泌体在肺损伤的用途


技术介绍

[0002]脂肪来源的间充质干细胞(ADMSCs)不仅具有多能性和可塑性，而且来源较为丰富，可以通过微创手术技术轻松收获，这使得ADMSCs有利于临床应用。
[0003]最近，ADMSCs的旁分泌功能被认为是基于MSC的治疗的主要介质，外泌体是一种小细胞细胞外膜囊泡，主要用于传递细胞特异性蛋白质以及各种细胞类型分泌的核酸。
[0004]细胞外囊泡(EV)是一个包括外泌体和微囊泡(MV)的术语，外泌体直径小于200nm，而MV直径可达1000nm。
[0005]MSCs及其囊泡的分泌组因其旁分泌或内分泌作用而为无细胞治疗提供了强大的工具。MSC衍生的EV的主要特征是：
[0006](1)非增殖性，可降低肿瘤形成的风险；
[0007](2)HLA
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I和HLA
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II阴性，可以异体使用，没有任何免疫反应风险；
[0008](3)体积小，允许从小毛细血管中通过；
[0009](4)不使用DMSO的情况下存储，多项临床研究表明了MSCs和MSC
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EVs对不同原因引起的肺损伤的影响和机制。
[0010]间充质干细胞及外泌体在ALI和ARDS中发挥免疫调节、抗炎、抗凋亡和抗纤维化功能。PGE2将巨噬细胞极化从M1改变为M2，IL10减少了中性粒细胞向肺的募集，而IDO增强了肺的抗菌活性。此外，MSCs也阻碍了B细胞的增殖、分化和趋化特征。间充质干细胞可进一步增强毛细血管屏障的恢复，恢复肺泡ATP，其中分泌的生长因子KGF、VEGF和HGF可对肺泡细胞发挥保护作用。在ALI模型中，KGFmRNA参与了MSC
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EV治疗引起的免疫调节。
[0011]据报道，通过MSC
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EVs转移的功能性线粒体可增强原代人肺泡细胞的线粒体功能并增强其修复肺损伤的能力。此外，MSC
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EV的作用已在大肠杆菌诱导的肺炎小鼠模型中进行了检验。数据表明，EV可以通过减少中性粒细胞和巨噬细胞募集以及MIP
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2水平来减少肺部炎症。已发现EV可降低肺水肿和内皮通透性，并且靶细胞上CD44的表达是EV结合和摄取到细胞中所必需的。据报道，EV介导的angiopoietin
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1(Ang1)mRNA的转移对于通过减少中性粒细胞流入和MIP
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2水平来减少炎症、内皮细胞保护和屏障修复很重要。此外，EV通过抑制TNF
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α的分泌和增强IL
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10的分泌在巨噬细胞中发挥免疫调节功能，在猪模型中，研究了MSC
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EVs对流感病毒诱导的ARDS的影响，现有技术中的外泌体在进行制备的时候制备纯度不够高，而且对肺部损伤产生的效果也比较低，为此设计一种脂肪间充质外泌体及其制备方法的来进一步优化上述方案。

技术实现思路

[0012]本专利技术的主要目的是为了提供一种脂肪间充质外泌体及其制备方法，本专利通过采用使用脂肪间充质干细胞外泌体通过雾化手段到达肺部，修复肺部损伤。
[0013]酶消化分离提取技术，无血清而培养体系，超滤提纯技术，雾化介导，实现对肺部损伤的高效修复功能。
[0014]本专利技术的目的可以通过采用如下技术方案达到：
[0015]一种脂肪间充质外泌体，包括1ml宫内膜干细胞外泌体和2ml生理盐水。
[0016]一种脂肪间充质外泌体的制备方法，包括如下步骤：
[0017]脂肪干细胞制备步骤：
[0018]将50ml脂肪组织样本采集至采集瓶内，并喷洒酒精放入生物安全柜静置5min以上；
[0019]准备相应的离心管若干5
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10个，每个离心管中加入生理盐水20ml，备用；
[0020]用25ml移液管吸取静置后分层的采集瓶中的脂肪样本中下层液体弃掉，再用25ml移液管吸取脂肪组织，每个离心管中加入等体积的脂肪组织每管加20
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25ml，盖好盖子，上下颠倒几次，摇匀；
[0021]其中上层是油脂层，中层是脂肪组织层，下层是肿胀液层；
[0022]将上述处理分离完成的脂肪组织配平离心；
[0023]其中配平采用电子天平配平，且离心旋转为1500rpm,离心5min；
[0024]将步骤三中的脂肪组织进行离心处理,离心后分上中下三层，上层的油脂和下层的清洗液吸出弃掉，再用25ml移液管吸取脂肪组织至干净的离心管中，每管加入等量脂肪组织，避开白色筋膜组织；
[0025]将加有脂肪组织的离心管里加入等体积的生理盐水总量不超过45ml，盖好盖子，上下颠倒几次摇匀，同上述操作进行第二次离心；
[0026]离心完后，同样是吸出脂肪油脂和下层清洗液，避开白色筋膜组织将脂肪组织用25ml移液管吸出到干净的离心管中；
[0027]将清洗的脂肪组织放入50mL离心管中，用弯尖头精细剪剪碎组织，约剪300次，，剪碎后组织1mL重0.8g，脂肪组织量为15
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25ml，加入生理盐水至总体积为40mL，混匀；
[0028]30mg胶原酶I溶解于10mlPBS溶液，0.22um过滤除菌后2倍稀释，获得浓度为1mg/ml的胶原酶I；
[0029]将洗涤后的脂肪加入1mg/ml的胶原酶I比例为1：1，置于恒温振荡培养床内，37℃，130rpm条件下消化40分钟；
[0030]消化完成后1300rpm离心10分钟，去上清，底部沉淀为脂肪干细胞，PBS重悬洗涤离心2次；
[0031]重复上述步骤十操作，离心后将下清液转移至50mL离心管，并取1.5～2.0mL加入冻存管用于留样；
[0032]修复肺部损伤步骤：
[0033]使用脂肪间充质干细胞外泌体通过雾化手段到达肺部；
[0034]通过雾化介导进入至肺部修复肺部损伤。
[0035]优选的，消化完后1300rpm离心10分钟，去上清，底部沉淀为脂肪干细胞，PBS重悬洗涤离心2次，根据洗涤后获的脂肪组织，1ml脂肪组织接种一个T175细胞培养瓶进行接种培养，且每T
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175培养瓶加入22ml培养基，标记好培养标签，摇匀，放入37℃，5％CO2恒温培养箱静置培养。
[0036]优选的，换液时在无菌操作情况下并防止细胞间的交叉污染，每次只操作同一供者细胞的操作，移液管只用于对同一种液体的吸取；
[0037]换液周期根据细胞状况不同有所调整；
[0038]每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
[0039]本专利技术的有益技术效果：
[0040]本专利技术提供的一种脂肪间充质外泌体及其制备方法，将50ml脂肪组织样本采集至采集瓶内，并喷洒酒精放入生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质外泌体，其特征在于：包括脂肪干细胞外泌体和生理盐水的用量比例为1：2。2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质外泌体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：外泌体制备步骤：步骤一：脂肪干细胞培养至P4
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P10代次，P4
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P10代每次传代取旧的培养液200ml，保存于
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80℃条件下用于脂肪外泌体的提取；步骤二：旧的培养液移入50ml离心管中，1000g，离心10分钟，保留上清移入新的50ml离心管中；步骤三：使用10KD超滤管，每支超滤管加入15ml离心后的上清，4000g，离心20分钟，保留超滤管内超滤膜上的浓缩液200ul，即为外泌体原液,置于新的15ml离心管内；步骤四：重复步骤三的操作，获得大量的外泌体原液，保存于
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80℃条件下；脂肪干细胞制备步骤：将50ml脂肪组织样本采集至采集瓶内，并喷洒酒精放入生物安全柜静置5min以上；准备相应的离心管若干5
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10个，每个离心管中加入生理盐水20ml，备用；用25ml移液管吸取静置后分层的采集瓶中的脂肪样本中下层液体弃掉，再用25ml移液管吸取脂肪组织，每个离心管中加入等体积的脂肪组织每管加20
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25ml，盖好盖子，上下颠倒几次，摇匀；其中上层是油脂层，中层是脂肪组织层，下层是肿胀液层；将上述处理分离完成的脂肪组织配平离心；其中配平采用电子天平配平，且离心旋转为1500rpm,离心5min；将步骤三中的脂肪组织进行离心处理,离心后分上中下三层，上层的油脂和下层的清洗液吸出弃掉，再用25ml移液管吸取脂肪组织至干净的离心管中，每管加入等量脂肪组织，避开白色筋膜组织；将加有脂肪组织的离心管里加入等体积的生理盐水总量不超过45ml，盖好盖子，上下颠倒几次摇匀，同上述操作进行第二次离心；离心完后，同样是吸出脂肪油脂和下层清洗液，避开白色筋膜组织将脂肪组织用25ml移液管吸出到干净的离心管中；将清洗的脂肪组织放入50mL离心管中，用弯尖头精细剪剪碎组织，约剪300次，，剪碎后组织1mL重0.8g，脂肪组织量为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：季子云，陈正琳，李杰，刘畅，贺燕玲，贺激光，
申请(专利权)人：杭州凤喆凰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：