一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法技术

本发明专利技术公开了一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法。该方法为：上游引物或下游引物中的其中一条引物跨越融合基因的断点，该跨越断点的引物的3

【技术实现步骤摘要】
一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法


[0001]本专利技术属于融合基因检测
，具体涉及一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法。

技术介绍

[0002]诸多研究不断表明，基因融合与各种疾病，特别是癌症的发生发展紧密相关，甚至是一些癌症的直接诱因，所以基因融合也成为了当前基因组学大数据分析中的一项重要研究内容。美国FDA(Food and Drug Administration)已经批准了一些针对特定基因融合的药物，以治疗相应的癌症，基因融合可能与各种癌症的发生发展紧密相关，这些融合基因还可能是潜在的药物靶点，非常有必要对它们进行深入的研究。
[0003]精准医学时代，靶向特异区段测序的需求日益增加，样本量逐年增多，只用传统的Sanger法或目标区域杂交捕获测序价格昂贵。因此多重PCR的扩增子测序适用性强，可以针对连续区段，外显子靶标以及其他指定位点和基因融合，设计特异性引物，一次检测多种变异类型多种变异位点有着重要的临床意义和广泛的应用前景。但是仍有许多限制因素，其中引物的特异性差、扩增效率不均一，会直接影响变异的检出性能及panel的大小，这种影响在融合检测中表现尤为明显，融合阳性样本量少且珍贵，融合丰度低易出现假阳性结果，甚至会耽误患者治疗，因此，提高融合引物的特异性及检测灵敏度显得尤为重要。
[0004]现有技术中RNA融合基因检测的引物设计方法多为图1所示，分别在两个发生融合的基因上设计引物，基因A和基因B发生融合的连接点即为融合基因断点，在设计引物对时，引物1(上游引物)在基因A的区域内进行设计，引物2(下游引物)在基因B的区域内设计。该方法设计的引物在检测融合基因时，引物特异性较差，检测融合基因的灵敏度也较差，易出现假阳或假阴性结果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法。主要解决现有技术中融合基因检测特异性差、灵敏度不高的技术问题。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0007]一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法，该方法为：上游引物或下游引物中的其中一条引物跨越融合基因的断点，该跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度不超过15bp。
[0008]作为优选实施方案，所述跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度为3bp
‑
15bp。
[0009]作为优选实施方案，所述跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度为3bp
‑
8bp。
[0010]作为优选实施方案，所述方法设计的引物用于检测RNA融合基因时，采用rhAmpSeq多重PCR进行文库构建。
[0011]作为优选实施方案，所述RNA融合基因为以下Fu_1～Fu_19融合基因：
[0012]Fu_1：LMNA_5__NTRK1_11_NM_170707_NM_002529；
NO.16所示；
[0041]融合基因Fu_9的引物对为Fu_9
‑
F和Fu_9
‑
R1，序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
[0042]融合基因Fu_10的引物对为Fu_10
‑
F和Fu_10
‑
R，序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；
[0043]融合基因Fu_11的引物对为Fu_11
‑
F和Fu_11
‑
R，序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；
[0044]融合基因Fu_12的引物对为Fu_12
‑
F和Fu_12
‑
R，序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
[0045]融合基因Fu_13的引物对为Fu_13
‑
F和Fu_13
‑
R，序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；
[0046]融合基因Fu_14的引物对为Fu_14
‑
F和Fu_14
‑
R，序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；
[0047]融合基因Fu_15的引物对为Fu_15
‑
F和Fu_15
‑
R，序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；
[0048]融合基因Fu_16的引物对为Fu_16
‑
F和Fu_16
‑
R，序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；
[0049]融合基因Fu_17的引物对为Fu_17
‑
F和Fu_17
‑
R，序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；
[0050]融合基因Fu_18的引物对为Fu_18
‑
F和Fu_18
‑
R，序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示；
[0051]融合基因Fu_19的引物对为Fu_19
‑
F和Fu_19
‑
R，序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示。
[0052]上述每个融合基因的引物对，其中一条为跨断点引物，另一条为非跨断点引物。
[0053]本专利技术还提供一种检测RNA融合基因的方法，该方法包括如下步骤：
[0054]步骤1，提取检测样本的RNA，并反转录成cDNA；
[0055]步骤2，利用上述方法设计引物，对目标区域进行PCR扩增；
[0056]步骤3，对扩增的目标产物进行纯化；
[0057]步骤4，采用纯化的目标产物配制Index PCR反应体系，并进行第二轮PCR扩增；
[0058]步骤5，对扩增的目标产物进行纯化，构建目标文库，对文库进行上机测序和数据分析。
[0059]作为优选实施方案，所述步骤4中采用的引物为I5 index_primer和I7index_primer。
[0060]本专利技术提供的跨断点设计引物法如图2所示，基因A和基因B发生融合的连接点即为融合基因断点，本专利技术的引物设计方法是：引物1(上游引物)或引物2(下游引物)其中一条引物跨越断点，图2中为引物1跨越断点，可选的也可以是引物2跨越断点。跨越断点的引物的3
’
端(图2中箭头指向的一端为3
’
端)距离断点的长度不超过15bp。
[0061]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0062]本专利技术跨断点设计引物的方法是专利技术人根据自身的技术平台特点和建库方法提
出的开创性的推测尝试，然后进一步通过实验验证了跨断点设计引物可以显著提高融合基因检测的特异性和灵敏度。
附图说明
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于RNA融合基因检测的引物设计方法，该方法为：上游引物或下游引物中的其中一条引物跨越融合基因的断点，该跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度不超过15bp。2.如权利要求1所述的用于RNA融合基因检测的引物设计方法，其特征在于：所述跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度为3bp
‑
15bp。3.如权利要求1所述的用于RNA融合基因检测的引物设计方法，其特征在于：所述跨越断点的引物的3
’
端距离断点的长度为3bp
‑
8bp。4.如权利要求1所述的用于RNA融合基因检测的引物设计方法，其特征在于：所述方法设计的引物用于检测RNA融合基因时，采用rhAmpSeq多重PCR进行文库构建。5.如权利要求1所述的用于RNA融合基因检测的引物设计方法，其特征在于，所述RNA融合基因为以下Fu_1～Fu_19融合基因：Fu_1：LMNA_5__NTRK1_11_NM_170707_NM_002529；Fu_2：TERT_11__ALK_5_NM_198253_NM_004304；Fu_3：ROS1_33__PDGFRB_19_NM_002944_NM_002609；Fu_4：KIAA1549_18__BRAF_10_NM_001164665_NM_004333；Fu_5：HIP1R_21__RET_11_NM_003959_NM_020975；Fu_6：KLHL7_4__BRAF_10_NM_018846_NM_004333；Fu_7：SND1_18__BRAF_10_NM_014390_NM_004333；Fu_8：RBPMS_5__MET_15_NM_001008710_NM_000245；Fu_9：THEMIS_4__ROS1_35_NM_001010923_NM_002944；Fu_10：FUT9_1__ROS1_31_NM_006581_NM_002944；Fu_11：WDFY3_2__BRAF_16_NM_014991_NM_004333；Fu_12：ZFAT_2__FGFR1_8_NM_001029939_NM_023110；Fu_13：HIBADH_4__BRAF_6_NM_152740_NM_004333；Fu_14：FGFR2_4__TMTC2_12_NM_000141_NM_152588；Fu_15：LETM2_6__FGFR1_13_NM_144652_NM_023110；Fu_16：CAPZA2_4__MET_11_NM_006136_NM_000245；Fu_17：SLC8A1_7__ALK_7_NM_021097_NM_004304；Fu_18：DANCR_4__PDGFRA_13_NR_145129.1_NM_006206；Fu_19：SLC22A16_7__ROS1_32_NM_033125_NM_002944。6.如权利要求5所述的用于RNA融合基因检测的引物设计方法，其特征在于，针对融合基因Fu_1～Fu_19设计的引物对分别为以下引物序列：融合基因Fu_1的引物对为Fu_1
‑
F和Fu_1
‑
R1，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；融合基因Fu_2的引物对为Fu_2
‑
F和Fu_2
‑
R1，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；融合基因Fu_3的引物对为Fu_3
‑
F和Fu_3
‑
R1，序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；融合基因Fu_4的引物对为Fu_4
‑
F和Fu_4
‑
R1，序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书九页序列表七页附图二页，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：