一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株及其应用。本发明专利技术以CHO

【技术实现步骤摘要】
一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)已是FDA和NMPA等药品监管部门认可度最高的生产生物技术药物的工程细胞。目前治疗性生物制品的治疗领域已不断扩展至慢性疾病和老年病，加之药品普惠大众的医保和个人支付方式的变化，产品销售价格已是市场扩张的主要限制性因素之一。监管部门对治疗性生物制品的质量和生产过程控制的要求快速提升，大幅度降低产品生产的“产成本”已经成为技术发展的关键瓶颈问题。延长CHO工程细胞的生产周期是解决这一问题的方法之一。
[0003]在细胞培养过程中，细胞死亡分为三个方面，细胞凋亡，细胞衰老和机械损伤。其中细胞凋亡占比最大，通过分子手段来改善细胞凋亡情况，可以有效提高CHO细胞的抗逆能力。目前研究较为清楚的凋亡途径，主要包括内质网压力诱导途径、膜受体通路及线粒体激活半胱天冬酶(Caspases)蛋白的生化调节途径三种。Wong等人在CHO细胞批次和流加培养过程中对转录组进行分析，发现早期凋亡信号基因在培养后期的表达是存在差异的。因此促凋亡基因表达的稳定下调和抗凋亡基因表达的上调，使得CHO细胞表现出更高抗细胞凋亡能力，可改善细胞培养和表达性能。
[0004]现有技术只是改善了细胞凋亡的情况，但对细胞衰老的改善没有研究。因此通过继续改善细胞抗衰老能力，以期延长细胞培养时间。

技术实现思路
r/>[0005]为解决上述技术问题，本专利技术构建一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株，延长CHO细胞的有效培养时间从而提高表达外源蛋白能力，该细胞株的应用为CHO工程细胞株的构建提供技术基础。
[0006]本专利技术的第一个目的是构建一株整合了端粒酶逆转录酶的CHO细胞株，所述CHO细胞株可稳定增强表达端粒酶逆转录酶。
[0007]进一步地，所述的端粒酶逆转录酶来源于中国仓鼠卵巢细胞，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
[0008]进一步地，编码所述的端粒酶逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，所述的端粒酶逆转录酶定点整合于CHO细胞基因组中。
[0010]进一步地，所述的端粒酶逆转录酶定点整合于CHO细胞基因组中Cdk6位点。进一步优选整合于CHO细胞基因组中Cdk6基因内含子区域。
[0011]进一步地，所述的CHO细胞株以CHO
‑
K1细胞为出发细胞株。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供所述的CHO细胞株的构建方法，包括如下步骤：
[0013]S1、将编码端粒酶逆转录酶的基因构建到质粒上得到重组质粒；
[0014]S2、将重组质粒转染至CHO宿主细胞中，并定点整合至表达位点；
[0015]S3、筛选成功整合并过表达端粒酶逆转录酶的细胞株。
[0016]进一步地，所述质粒为PUC57
‑
BxbI
‑
TERT质粒。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供所述的CHO细胞株在表达外源蛋白中的应用。
[0018]进一步地，所述应用是以所述CHO细胞株为出发细胞株，将待表达的外源蛋白整合至CHO细胞株内，进行外源蛋白表达。
[0019]本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术以CHO
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K1为出发细胞株构建了TERT过表达细胞株CHO
‑
K1
‑
TERT。对其进行流加培养，发现细胞株CHO
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K1
‑
TERT通过减缓细胞衰老和细胞凋亡，将最高活细胞密度从15
×
106cells/mL提高到了25
×
106cells/mL，培养时间从13d延长到了19d。并验证了其表达外源蛋白(HSA)的能力，HSA的最终表达量可以达到783mg/L，是以CHO
‑
K1为出发细胞株构建的CHO
‑
K1
‑
HSA
‑
7表达量的两倍左右。该细胞株的应用为CHO工程细胞株的构建提供技术基础。
附图说明：
[0021]图1为四个位点整合TERT流式分选结果；
[0022]图2为定点整合TERT的细胞株流加培养生长情况；
[0023]图3为定点整合TERT基因的CHO
‑
K1细胞株；A：CHO
‑
K1
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TERT流式分选结果；B：5
’
PCR结果；C：3
’
PCR结果；D:细胞株CHO
‑
K1
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TERT qPCR结果；
[0024]图4为CHO
‑
K1
‑
TERT细胞株摇瓶流加培养实验结果；A：CHO
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K1和CHO
‑
K1
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TERT细胞株细胞密度和细胞活率变化曲线；B：CHO
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K1和CHO
‑
K1
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TERT细胞株细胞生长曲线C：CHO
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K1和CHO
‑
K1
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TERT细胞株细胞对数生长期拟合曲线；
[0025]图5为流式细胞仪检测细胞株CHO
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K1
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TERT细胞周期结果；
[0026]图6为细胞株CHO
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K1
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TERT细胞凋亡和细胞衰老检测结果；A：CHO
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K1细胞凋亡结果；B：CHO
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K1
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TERT细胞凋亡结果；C：细胞衰老结果；
[0027]图7为CHO
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K1
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TERT细胞株表达外源蛋白HSA情况；A：流式分选结果；B：Western blot检测结果，1：KT
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HSA
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3、2：KT
‑
HSA
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10、3：KT
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HSA
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19；C：摇瓶流加培养细胞密度和细胞活率变化曲线；D：外源蛋白(HSA)表达情况。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0029]涉及的检测方法：
[0030]一、细胞凋亡检测方法(Annexin V
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FITC/PI Apoptosis Detection Kit，诺唯赞公司)：
[0031]在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株整合端粒酶逆转录酶的CHO细胞株，其特征在于，所述CHO细胞株中稳定增强表达端粒酶逆转录酶。2.根据权利要求1所述的CHO细胞株，其特征在于，所述的端粒酶逆转录酶来源于中国仓鼠卵巢细胞，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的CHO细胞株，其特征在于，编码所述的端粒酶逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的CHO细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕴，金坚，丁学峰，李华钟，蔡燕飞，段作营，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：