本发明专利技术公开了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片。包括用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应的一个核酸扩增腔，预先置有核酸扩增试剂；包括开设在核酸扩增腔上方的芯片上表面的加样口，与外界相通；包括用于核酸扩增产物检测的一个或两个CRISPR检测腔，内置有CRISPR检测试剂；加样口、核酸扩增腔、CRISPR检测腔、加样口依次之间通过芯片内流道连通构成一个环形循环通道。本发明专利技术可快速有效地实现核酸扩增及其产物中目的基因和内参基因的高特异性一体化集成检测，避免了气溶胶释放到周围环境中，同时提高了CRISPR检测试剂的利用率，降低了检测成本，简化了核酸检测操作和流程，提升了检测结果准确度。提升了检测结果准确度。提升了检测结果准确度。
【技术实现步骤摘要】
一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片
[0001]本专利技术公开了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片，尤其是涉及到一种利用双重CRISPR对核酸扩增产物进行目的基因和内参基因一体化集成检测的方法和芯片，属于微生物学和生化分析领域。
技术介绍
[0002]核酸扩增技术已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。常用的核酸扩增技术有聚合酶链式扩增(PCR)以及各种等温扩增方法，如环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。然而，目前许多核酸扩增还在使用实时光学检测，所用设备较为复杂，不适用于现场筛查。除了实时荧光检测之外，终点荧光检测也是核酸扩增产物检测的一种方法。但是，嵌入式核酸荧光染料在检测过程中缺乏特异性，容易造成假阳性，因此需要特异性更高的检测技术。
[0003]成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成CRISPR/Cas系统。某些Cas蛋白，如Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas13a蛋白、Cas14蛋白等，在crRNA链的引导下能特异性地结合目标链。同时，这些Cas蛋白结合目标链后会触发一种新的酶活性，无差别地切割任意单链DNA(ssDNA)。这一活性被称为旁路切割活性。在ssDNA两端修饰荧光基团和猝灭基团，当ssDNA探针被切割后，荧光基团和淬灭基团分离从而产生荧光。这种对单链DNA的反式切割是高效的，并且由于Cas蛋白的旁路切割是一个酶促反应，具有信号放大作用，因此具有很高的检测灵敏度。同时，Cas蛋白是在crRNA的引导下对目标链进行识别，具有很好的特异性。因此CRISPR/Cas系统可作为核酸检测的工具，最终利用可视化荧光检测仪器可观察检测结果。
[0004]但是，目前核酸扩增技术和CRISPR核酸检测技术还存在着一些不足，有待改进。第一个主要问题是在核酸扩增结束后，需要将核酸扩增产物转移到CRISPR体系中，并进行混合，增加了操作复杂性。此外，如果扩增是在一个单独的反应管中进行，就需要在核酸扩增结束后将扩增管打开，加入检测液。开盖过程中，扩增产物的气溶胶容易扩散到引起环境中，有可能会导致后续检测的假阳性结果。第二个主要问题是，目前已有研究还无法在同一个体系中进行双重CRISPR检测。这是由于CRISPR体系中的具有旁路切割活性的Cas蛋白无差别地切割任意单链DNA，无法区分两个或多个检测靶标。如果除了目的基因，还需要检测内参基因，则需要使用两个含Cas蛋白的体系分别独立地检测目的基因和内参基因，检测过程较为繁琐；并且Cas蛋白容易失活，失去旁路切割活性，即使存在目的基因，也无法产生荧光。所以当目的基因检测无荧光时，无法根据内参基因检测的结果来确定是因为不存在目的基因还是Cas蛋白失活导致。
[0005]针对上述问题，本专利技术提出了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和相应的芯片，能够很好的实现核酸扩增和一体化集成CRISPR检测。该芯片是密闭的，可以避免气溶胶释放到周围环境中。其次，该方法和芯片集核酸扩增、目的基因的检测和内参基因的检测过程于一体，简化了目的基因和内参基因的检测流程。此外，目的基因检测结束后，其体系中
的Cas蛋白又转移到了内参基因检测体系中，即目的基因检测和内参基因检测所使用的Cas蛋白是一样的。当目的基因检测无荧光、内参基因检测有荧光时，即可确定是因为不存在目的基因导致的目的基因检测无荧光，避免了上述无法判断的情况，提升了检测结果准确度。
技术实现思路
[0006]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提出了一种一体化集成的CRISPR核酸检测方法和芯片，可快速有效地实现核酸扩增及其产物中目的基因和内参基因的高特异性一体化集成检测。该方法和芯片避免了气溶胶释放到周围环境中，同时提高了CRISPR检测试剂的利用率，降低了检测成本。此外，还简化了核酸检测操作和流程并提升了检测结果准确度。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一、一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片：
[0009]所述芯片内部包含一个核酸扩增腔、一或两个CRISPR检测腔，以及将这些腔相连的通道，具体介绍如下：
[0010]包括一个核酸扩增腔，用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应，核酸扩增腔内预先置有预先包埋或冻干的核酸扩增试剂；
[0011]包括一个加样口，开设在核酸扩增腔上方的芯片上表面且与外界相通，待测样本溶液从加样口加入，核酸扩增腔和加样口通过芯片内部的流道连通；
[0012]包括一个或两个CRISPR检测腔，用于核酸扩增产物检测，CRISPR检测腔预先内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂；
[0013]核酸扩增腔和加样口之间、核酸扩增腔和其相邻的一个CRISPR检测腔之间、两个CRISPR检测腔之间、靠近加样口的CRISPR检测腔和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，所有芯片内部的流道构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环通道，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个CRISPR检测腔，完成目的基因和内参基因一体快捷迅速的CRISPR核酸检测。
[0014]芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔和CRISPR检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔和CRISPR检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
[0015]所述的核酸扩增腔位于芯片内的左侧、右侧或者底侧，CRISPR检测腔位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧。核酸扩增腔和CRISPR检测腔位于芯片内的不同侧边。
[0016]以核酸扩增腔和加样口之间所连通的芯片内部的流道作为入口流道，所述的靠近加样口的CRISPR检测腔经一芯片内部的流道连通到入口流道中，不是直接连通到加样口，也即靠近加样口的CRISPR检测腔和加样口之间的芯片内部的流道为在入口流道到CRISPR检测腔之间的芯片内部的流道。CRISPR检测腔经一芯片内部的流道连通到入口流道的连通点高于核酸扩增腔中所盛样品液面的最高点。
[0017]所述的核酸扩增腔为竖直的空腔，位于加样口正下方的芯片左侧或者右侧且直接和加样口连通，核酸扩增腔的口径大于其他芯片内部的流道，使得方便加入待测样本溶液。这种情况下，核酸扩增腔自身相当于承担了入口流道的功能，CRISPR检测腔经芯片内部的流道直接连通到核酸扩增腔，相当于连通到入口流道。
[0018]邻近加样口的CRISPR检测腔和入口流道之间通过气体连通通道连通，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力实现，无需任何外界的泵、阀。
[0019]位于顶侧的CRISPR检测腔和入口流道之间连通的芯片内部的流道以斜向下、斜向上或者水平布置，这样使得后续操作CRISPR核酸检测时候能够不让CRISPR检测腔内的溶液流出。
[0020]位于芯片内的左侧或者右侧的CRISPR检测腔和入口流道位于芯片内的不同侧。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：包括一个核酸扩增腔(3)，用于加入、容纳待测样本溶液进行核酸扩增反应，核酸扩增腔(3)内预先置有核酸扩增试剂；包括一个加样口(2)，开设在核酸扩增腔(3)上方的芯片上表面且与外界相通；包括一个或两个CRISPR检测腔(4/5)，用于核酸扩增产物检测，CRISPR检测腔(4)预先内置有目的基因CRISPR检测试剂；核酸扩增腔(3)和加样口(2)之间、核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，所有芯片内部的流道构成一个环形循环通道。2.根据权利要求1所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)位于芯片内的左侧、右侧或者底侧，CRISPR检测腔(4/5)位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧。3.根据权利要求2所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：以核酸扩增腔(3)和加样口(2)之间所连通的芯片内部的流道作为入口流道，所述的CRISPR检测腔(4/5)经芯片内部的流道连通到入口流道中，不是直接连通到加样口，CRISPR检测腔(4/5)经芯片内部的流道连通到入口流道的连通点高于核酸扩增腔(3)中所盛样品液面的最高点。4.根据权利要求2所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的核酸扩增腔(3)为竖直的空腔，位于加样口(2)正下方的芯片左侧或者右侧且直接和加样口(2)连通。5.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：位于顶侧的CRISPR检测腔(5)和入口流道之间连通的芯片内部的流道以斜向下、斜向上或者水平布置。6.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的CRISPR检测腔(4)数量为一个，所述的CRISPR检测腔(4)位于芯片内的左侧、右侧或者顶侧，所述的CRISPR检测腔(4)内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂，核酸扩增腔(3)和加样口之间、核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔(4/5)之间、CRISPR检测腔(4/5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连通，三个芯片内部的流道连通一起构成一个环形循环通道。7.根据权利要求3所述的一种一体化集成的CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述的CRISPR检测腔(4、5)数量为两个：一个CRISPR检测腔(4)位于芯片内的左侧或者右侧且内置有CRISPR检测试剂，；另一个CRISPR检测腔(5)位于芯片内的顶侧且内置有内参基因特异性的crRNA溶液或冻干试剂；核酸扩增腔(3)和加样口之间、核酸扩增腔(3)和左侧或者右侧的CRISPR检测腔(4)之间、左侧或者右侧的CRISPR检测腔(4)和顶侧的CRISPR检测腔(5)之间、顶侧的CRISPR检测腔(5)和加样口之间均通过芯片内部各自的流道连...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，朱媛媛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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