利用亲和超滤-液质联用技术筛选醛糖还原酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用亲和超滤

【技术实现步骤摘要】
利用亲和超滤
‑
液质联用技术筛选醛糖还原酶抑制剂的方法


[0001]本专利技术属于医药
，涉及一种利用亲和超滤
‑
液质联用技术筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。

技术介绍

[0002]在人们生活不断提高的同时，人群中糖尿病患者的比例也是逐年增加。糖尿病往往伴随着很多并发症，比如肾脏疾病、周围神经病变及视网膜病变。目前对糖尿病并发症的治疗策略仅仅是补偿治疗，通过控制血糖只能减缓病症，并不能起到预防或者治愈疾病的目的。糖尿病代谢涉及到多种葡萄糖毒性机制，包括多元醇途径、蛋白质的非酶糖基化、己糖胺途径等。醛糖还原酶(AR)抑制剂在多元醇途径中起着关键的作用，在预防和延缓糖尿病并发症上也起着关键的作用，成为治疗糖尿病的潜在药物。而人工合成的AR抑制剂虽然效果好，但深受毒副作用的影响。仅有的临床使用的AR抑制剂依帕司他(epalrestat)至今没有得到美国FDA许可。因此迫切需要一种高效，快速的方法从传统中药宝库中筛选天然无毒的醛糖还原酶抑制剂。
[0003]近年来天然黄酮类是研究最多且报道最多的传统中药来源的醛糖还原酶抑制剂。目前筛选中药中有效成分的过程中，大多是基于传统的天然产物化学分离纯化、鉴定、体外验证的方法，但是多步骤分离纯化是相当费时费力的，而且还会存在相当严重的人为误差，直接从植物中筛选生物活性化合物的效率很低。因此需要寻找一种高效快速筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，为筛选醛糖还原酶植物来源的抑制剂提供依据。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供一种快速高效的利用亲和超滤
‑
液质联用技术筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。该方法使用植物提取物和醛糖还原酶为原料，利用受体配体亲和吸附、超滤分离、高效液相色谱筛选以及液质联用鉴定，并通过体外活性验证，筛选植物提取物中的醛糖还原酶抑制剂，为高效快速筛选醛糖还原酶植物来源的抑制剂提供依据。
[0005]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0006]利用亲和超滤
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液质联用技术筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1，将植物样品粉碎，有机溶剂加热回流提取，得到提取液，减压旋蒸得到植物提取物；
[0008]步骤2，取SD大鼠晶状体，匀浆后通过硫酸铵梯度法得到醛糖还原酶；
[0009]步骤3，孵育：将植物提取物、醛糖还原酶和磷酸钠缓冲溶液混合均匀后孵育，使醛糖还原酶和样品中的有效成分结合；
[0010]步骤4，离心：将孵育完的体系转移到超滤离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，弃去滤液；
[0011]步骤5，清洗：向超滤离心管上层加入磷酸钠缓冲溶液，混匀后，4℃、12000rpm离心15分钟，弃去滤液，重复操作3次；
[0012]步骤6，解吸：向超滤离心管上层加入解离剂，混匀并静置10分钟后，4℃、12000rpm离心15分钟，收集滤液，重复操作3次并合并洗脱液；
[0013]步骤7，分析：将洗脱液氮气吹干后，复溶于色谱甲醇中，13300rpm离心30分钟后取上清液用于HPLC和LC
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MS分析鉴定；
[0014]步骤8，对鉴定出的化学成分进行醛糖还原酶抑制效果测定，验证结果。
[0015]本专利技术所述的植物为常见的中药，在本专利技术具体实施方式中，采用的植物为黄芩。
[0016]优选地，步骤1中，有机溶剂为30倍体积的70％乙醇，回流提取次数为3次。
[0017]优选地，步骤2中，硫酸铵梯度法梯度浓度分别为0％、40％、50％和75％。
[0018]优选地，步骤3中，磷酸钠缓冲溶液的pH为6.2，孵育条件为37℃、30分钟。
[0019]优选地，步骤4中，超滤离心管规格为10kDa。
[0020]优选地，步骤6中，解离剂为甲醇。
[0021]优选地，步骤7中，液相条件为：C18反相色谱柱(SunFireTM，250mm
×
4.6mm，Waters)，以0.1％磷酸
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水(A)和乙腈溶液(B)作为流动相，梯度程序为：0
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5min，10％
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30％B；5
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15min，30％
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36％B；15
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20min，36％
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64％B；20
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25min，64％
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80％B；25
‑
30min，80％
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80％B；流速1mL/min、进样体积为10μL、检测波长为260nm。
[0022]优选地，步骤7中，质谱条件为：液相色谱与质谱连接，质谱离子源为ESI源，分析模式为负离子模式TOF MS
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IDA
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TOF MS/MS，扫描范围m/z为100
‑
1000，ISVF电压：
±
4500V，气帘气CUR：35psi，雾化气为氮气，雾化气GS1：55psi，雾化气GS2：55psi，源温度：500℃，DP电压：
‑
80V，碰撞能量：
‑
35
±
15V。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0024](1)本专利技术首次利用亲和超滤
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液质联用技术筛选植物中潜在的醛糖还原酶抑制剂，通过亲和吸附、超滤分离可以快速定向的筛选出潜在配体，而传统的多步骤分离纯化是相当费时费力且有人为误差的。
[0025](2)本专利技术方法快速、简便、稳定、精密度高且重现性好。通过本专利技术的筛选方法，能够更有效的反应植物中具有醛糖还原酶抑制效果的潜在配体信息，选取的超滤膜孔径提供了更好的分离效果。
[0026](3)植物来源的潜在的醛糖还原酶抑制剂具有天然低毒性的特点，本专利技术建立的亲和超滤
‑
液质联用技术筛选体系为从天然药物中快速发现目标化合物具有重要意义。
附图说明
[0027]图1为醛糖还原酶与Fr.5的超滤
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液相色谱图。
[0028]图2为黄芩Fr.5中醛糖还原酶潜在配体的鉴定、相对结合亲和力和AR抑制率结果图。
具体实施方式
[0029]以下通过实施例和附图来进一步描述本专利技术，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。
[0030]实施例1
[0031](1)醛糖还原酶的制备
[0032]SD大鼠用麻醉机麻醉，摘取眼球于生理盐水中清洗，分离并收集晶状体(包含玻璃体)，取大鼠晶状体按照1.5mL预冷磷酸钠缓冲溶液/g晶状体的比例混合，匀浆，10000g离心15分钟。取上清，按照1mL预冷饱和硫酸铵溶液/g晶状体的比例混合使硫酸铵的饱和度至40％，边加边搅拌，颠倒混匀并静置15分钟(期间每两分钟颠倒混匀)，离心取上清。按照0.5mL预冷饱和硫酸铵溶液/g晶状本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用亲和超滤
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液质联用技术筛选黄芩中醛糖还原酶潜在抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将植物样品粉碎，有机溶剂加热回流提取，得到提取液，减压旋蒸得到植物提取物；步骤2，取SD大鼠晶状体，匀浆后通过硫酸铵梯度法得到醛糖还原酶；步骤3，孵育：将植物提取物、醛糖还原酶和磷酸钠缓冲溶液混合均匀后孵育，使醛糖还原酶和样品中的有效成分结合；步骤4，离心：将孵育完的体系转移到超滤离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，弃去滤液；步骤5，清洗：向超滤离心管上层加入磷酸钠缓冲溶液，混匀后，4℃、12000rpm离心15分钟，弃去滤液，重复操作3次；步骤6，解吸：向超滤离心管上层加入解离剂，混匀并静置10分钟后，4℃、12000rpm离心15分钟，收集滤液，重复操作3次并合并洗脱液；步骤7，分析：将洗脱液氮气吹干后，复溶于色谱甲醇中，13300rpm离心30分钟后取上清液用于HPLC和LC
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MS分析鉴定；步骤8，对鉴定出的化学成分进行醛糖还原酶抑制效果测定，验证结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，植物为黄芩。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，有机溶剂为30倍体积的70％乙醇，回流提取次数为3次。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，硫酸铵梯度法梯度浓度分别为0％、40％、50％和75％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，磷酸钠缓冲溶液的pH为6.2，孵育条件为37℃、30分钟。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊松，朱民强，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：