一种低分子肝素的基团修饰方法技术

本发明专利技术涉及一种低分子肝素的基团修饰方法。该方法以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，将所述的低分子肝素添加到氯磺酸－吡啶酯化试剂中，通过不同温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。应用该方法使低分子肝素的活性得到了提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗凝血药物天然低分子肝素的基团修饰方法。
技术介绍
低分子肝素作为一种重要的抗凝血药物，是由肝素经化学法、酶法或物理法降解或分离得到的分子量在3000 8000Da的糖氨聚糖片 段。与传统的肝素相比，低分子肝素具有抗血栓作用强、出血副作用 小、生物利用度高、血浆半衰期长等优点，在国际市场上已开始逐渐 取代肝素。肝素主要来源于畜禽副产物中的猪小肠黏膜、牛肺等，并且我国 是国际上最主要的肝素供应国，肝素钠是我国最重要的创汇产品之 一，80%的粗品或精品肝素出口到美国和德国。但我国应用的低分子 肝素主要依靠进口，是由国外将肝素钠再行降解形成低分子肝素后再 输入到我国。目前临床上用于抗血栓的药剂主要是低分子肝素制剂， 据IMS统计，2004年肝素市场的全球销售额己突破40亿美元，其中低分子肝素制剂在肝素制剂销售额的比例也逐年上升，目前递增率已 达到85%以上。2004年我国低分子肝素制剂的销售额达到了 3. 5亿人 民币。因此，不断完善从粗品原料到精品再到成品制剂完备的产业链， 研究低分子肝素制备技术的提升、创新将具有重要的经济意义和社会 效益。尽管我国畜禽副产物极为丰富，但目前其综合利用、精深加工水 平和技术装备落后；另外，目前天然低分子肝素的制备方法都存在着 生产成本高、效率低、环境污染大、不符合药典标准、产品毒副作用 大、活性低等缺陷。
技术实现思路
为解决
技术介绍
中的不足，本专利技术提供一种低分子肝素的基团修 饰方法，应用该方法使低分子肝素的活性得到了提高。本专利技术所采用的技术方案内容是该低分子肝素的基团修饰方法 以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，按如下步骤进行基团修饰将所述的低分子肝素添加到氯磺酸-吡啶酯化试剂中，通过不同 温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。上述的温度为15°C 25°C，时间为lh 2. 5h，酯化试剂与低分 子肝素量比例为10:1(体积质量比)，酯化试剂氯磺酸与吡啶的体积 比为l:l;温度为20。C，时间为2. 5h。本专利技术的有益效果是经过基团修饰后的抗凝血药物天然低分子肝素使低分子肝素的活性得到了提高。并具有以下特点(l)抗FXa 强，抗F II a弱，抗血栓作用强，出血副作用小；(2)分子量小， 生物利用度高，血浆半衰期长；(3)不与肝素结合蛋白结合，因此量 效关系稳定，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；(4)较 少与血小板结合，不易引起血小板减少。附图说明图1是反应温度对取代度的影响的关系曲线图； 图2是反应时间对取代度的影响的关系曲线图； 图3是酯化试剂比对取代度的影响的关系曲线图； 图4是硫酸基测定标准曲线图； 图5是低分子肝素标准品红外光谱图； 图6是修饰后低分子肝素红外光谱图。 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明实施例1、反应温度是Wolfrom法中影响取代度的的重要因素， 首先对反应温度的影响范围进行了单因素试验，其它两个因素反应时 间和酯化试剂比例分别为2h和1: 1，试验结果见图1。由图1可知， 随着反应温度的升高，取代度呈不断升高的趋势，主要是因为温度升 高使各官能团更易于被取代，从而使低分子肝素的取代度提高，但取 代度并不随着温度的升高不断增加，当温度超25"C时取代度反而下 降，主要与低分子肝素可被硫酸基取代的官能团的数量有关。在反应 温度继续升高时，反应剧烈程度增加，在添加酯化试剂过程中冒出大 量的黄色三氧化硫烟雾，同时导致LMWH结构的破坏，影响其活性， 故反应温度应控制在25°C以下为宜。实施例2、在进行了反应温度对取代度的影响作用以后，继续对4反应时间的影响作用进行了试验分析，反应温度为15°C，酯化试剂比为l:l，试验水平数为五个，试验结果见图2。根据不同反应时间对取代度的影响结果及图2可知随着反应时间的延长，取代度不断增加。但超2.5h后，取代度反而有所下降，主要与LMWH的结构有 关，在LMWH主体结构中共有3个可以取代的基团，反应时间延长 后已添加的硫酸基团可能被其它基团所取代，导致取代度的下降。所 以时间为1 h 2. 5h为宜。实施例3、不同的酯化试剂及其配比也是影响取代度的一个重要 因素，试验过程中研究了 Wolfrom法中酯化试剂的比例对取代度的影 响，反应时间2h，反应温度15'C，结果见图3。由图3可知随着氯 磺酸与吡啶比例的降低，取代度呈下降趋势，原因为酯化试剂中硫酸 基团的比例不断下降，能够取代低分子肝素结构上官能团的基团较少 从而使取代度也不断下降。试验分析结果表明3:1、 2:1、 1:1、 1:2、 1:3五个水平间差异均不显著，优选酯化试剂比为1:1，是考虑到反应 剧烈程度较小。实施例4、硫酸基含量测定方法及取代度(DS)测定方法。 硫酸基含量测定方法参照玫棕酸钠法(C6Na206)测定硫酸基含量， 要求所有玻璃容器采用稀硝酸清洗后再用蒸馏水冲洗干净。具体方法 如下a. BaCl2缓冲溶液的配制分别取2M的乙酸10mL， 0. 005M的BaCl22mL， 0. 02M的NaHC038mL， 后添加无水乙醇定容至100mL。b. 玫棕酸钠溶液的配制称取5mg玫棕酸钠于20mL水中溶解，后加入lOOmgL-抗坏血酸， 摇匀，无水乙醇定容至100mL。溶液颜色为淡棕色，30min后使用， 有效期两天。c. 硫酸基标准溶液的配制取2 12ug硫酸物(硫酸或硫酸钠)于O. 5mL水中。试验过程 中称取0. 500mg色谱纯硫酸钠定容至1000mL,备用。d. 具体步骤取O. 5mL待测样，标准液与水加入到试管中后，再加2mL乙醇，若产生沉淀进行离心至澄清；加入lmL BaCl2缓冲溶液与1. 5mL玫棕 酸钠溶液后摇匀于室温条件下暗室静置10min，颜色的强度采用分光 光度法进行测定，在520nm，颜色保持30min不变。取代度DS(degree of substitution)的测定设多糖分子量为 162n，其中n为单糖数目，-OH取代后变为-0S03Na，分子量增加102， 32为S的原子量，则有(注M为硫总含量；X为原LMWH硫酸基含量。通过测定X为0. 12) Wolfrom法正交试验取代度测定结果见表1。 'Wolfrom法L9(34)正交试验因素水平表 表1水平A(温度)/'CB(时间)/hC(酯化试剂比)1101.52:12151:13202.51:2Wolfrom法正交试验结果表2序号 A(温度)厂C B(时间)/h C酯化试剂比D(空列)取代度11i110.8221220.93313330.954210.925211.0163121.047121.0983131.1093311.12K!2.72.832.962.958.98K22.973.042.973.06K33.313.113.052.97Ki0.90.940.990.98K20.991.010.991.02K31.101.041.020.996Wolfrom法方差分析结果 表2变异来源平方和自由度均方F值A(温度)/'C0.0620.0315B(时间)/h0.01420.0073.5CpH0.00220週误差E0.00420.002总和T0.088对修饰条件影响较大的温度、时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低分子肝素的基团修饰方法，以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，其特征在于：按如下步骤进行基团修饰：将所述的低分子肝素添加到氯磺酸－吡啶酯化试剂中，通过不同温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽萍，李雷刚，崔素萍，刘妍妍，魏文义，贾健，李良玉，
申请(专利权)人：张丽萍，
类型：发明
国别省市：23[中国|黑龙江]