一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，它是由多肽序列Pep与铜离子构建而成；所述的多肽序列Pep序列为：HQHYHGGGGS

【技术实现步骤摘要】
一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于医药
，具体涉及一种具有赖氨酰氧化酶(LOX)活性的多肽类模拟酶及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]糖尿病骨的高糖微环境使得骨胶原交联过程中唯一的催化酶——赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)处于严重下调状态，成为糖尿病骨损伤延迟愈合甚至不愈合的主要原因。为此，在骨伤局部补充LOX，促进骨胶原的交联成熟，已成为加速糖尿病患者骨再生新的治疗策略。然而，目前该策略的最大障碍在于LOX的体外重组表达效率低下、结构不稳定以及复性后易失活。因此，开发一种简便易得、活性稳定的LOX活性替代物意义重大。
[0003]近年来，随着对天然酶分子的结构功能关系以及催化机制研究的不断深入，越来越多的研究者成功实现了以简单的合成小分子来替代复杂的天然酶，从而得到比天然酶制备更简便、活性更稳定的模拟酶。多肽凭借制备简单、稳定性好、免疫原性低、生物相容性高等优势成为构建模拟酶的理想材料，其组装方式与天然酶分子的折叠过程类似，并可为底物的结合提供有利的微环境。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出借助模拟酶的仿生思路，设计一种具有LOX活性的多肽模拟酶，并研究其结构和催化活性，以及在糖尿病骨缺损大鼠模型中的应用。
[0005]本专利技术的LOX多肽模拟酶(peptide mimic of LOX,PML)是一种源于LOX活性结构域氨基酸残基而设计的多肽片段(peptide,Pep)与活性中心二价铜离子的结合物。其三维结构类似于天然LOX，Pep通过组氨酸咪唑氮和邻醌氧与铜离子发生结合，表现出LOX活性，催化胶原交联反应，促进骨胶原的分泌和成熟，加速糖尿病骨愈合。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，它是由多肽序列Pep与铜离子构建而成；
[0008]所述的多肽序列Pep序列为：HQHYHGGGGS
‑
DOPA
‑
DDDD。
[0009]本专利技术提供一种具有LOX活性的多肽模拟酶的设计方法，包括以下步骤：
[0010](1)LOX活性结构域的解析：总结LOX催化胶原交联的关键结构及作用包括：催化中心Cu
2+
发挥稳定辅因子LTQ氧化态的作用；组氨酸参与Cu
2+
配位，稳定催化域；天冬氨酸提供阴离子环境，结合底物；LTQ与Cu
2+
配位的同时，参与氧化脱氨反应。
[0011](2)Pep序列的设计：利用仿生模拟酶的构建思路，本专利技术设计了源于LOX活性域的多肽序列(Pep：HQHYHGGGGS
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DOPA
‑
DDDD)，其中HQHYH为铜离子结合序列，DOPA为LTQ模型氨基酸，GGGGS为连接序列，DDDD为底物亲和序列。
[0012]本专利技术所述的Pep分子结构如下：
[0013][0014](3)PML分子的设计：鉴于Cu
2+
在LOX活性中的关键作用，将Cu
2+
掺入并稳定结合于氧化态的Pep分子中，设计出具有LOX活性的PML。
[0015](4)分子动力学模拟计算PML与LOX的构象一致性：首先使用Pymol开源版本构建了含有非标准残基的PML结构，使用Avogadro对整体结构进行了调整和优化，将初始结构进行能量最小化后使用Amber ff14SB力场进行分子动力学模拟，对PML的分子结构进行构象分析。
[0016]本专利技术还提供上述多肽模拟酶PML的制备方法，如下：
[0017](1)Pep的合成：采用固相合成策略，以Rink
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Amide
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MBHA树脂为固相载体，20％哌啶为Fmoc脱保护试剂，苯并三氮唑
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N,N,N',N'
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四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N
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二异丙基乙胺(DIEA)为缩合试剂和活化试剂，95％TFA
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2.5％Tis
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2.5％H2O为切割液，冰乙醚为多肽沉淀溶剂，合成Pep粗品，经制备液相纯化，冻干得到Pep纯品。
[0018](2)PML的制备：将等摩尔浓度的Pep与CuCl2水溶液等体积混匀，用1MNaOH调节pH至8.0，室温下氧化并反应12h，经透析除去游离CuCl2后冷冻干燥得到PML产物。
[0019]本专利技术提供PML的结构解析方法，包括：电喷雾质谱、X射线衍射分析、紫外
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可见光谱分析、傅里叶红外光谱分析、X射线光电子能谱分析等。
[0020]本专利技术提供PML催化胶原交联活性的评价方法：通过茚三酮检测考察PML催化前后胶原游离氨基含量变化，计算胶原交联程度。通过监测胶原交联反应产物过氧化氢含量，研究其催化动力学特征。
[0021]本专利技术提供PML制剂在糖尿病骨缺损大鼠模型中的应用，所述制剂为甲基丙烯酰化明胶(GelMA)制备的光固化水凝胶。
[0022]一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶的光固化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
[0023]分别称取200.00mg甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和10.00mg光引发剂LAP溶于2mL 37℃的超纯水中，用1M NaOH调节pH至7.4，经0.22μm滤膜过滤，即得浓度为10％的GelMA溶液；
[0024]将13.05mg的PML溶于1mL上述GelMA溶液，即得PMLGH溶液，经紫外光405nm照射1min后固化成形，即得。
[0025]本专利技术优点在于：基于仿生原理设计Pep分子，与铜离子高效结合构建LOX多肽模拟酶，实现了与LOX在三维结构
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体外活性
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催化机制上的高度一致。该模拟酶制备简单、活性稳定、生物相容性良好，进一步负载于GelMA凝胶中缓慢释放，长期维持有效治疗浓度，加速糖尿病骨缺损的愈合。
附图说明
[0026]图1a为LOX的三维模型；图1b为PML分子动力学模拟的三维构象；图1c为分子动力
学模拟过程总能量的变化；图1d为PML与LOX分子的叠加构象。
[0027]图2a为Pep与PML的X射线衍射(XRD)图谱；图2b为Pep与PML的紫外吸收光谱；图2c为Pep与PML的红外吸收光谱；图2d
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f为PML的X射线光电子能谱(XPS)：图2d为PML的O1s精细谱；图2e为PML的N1s精细谱；图2f为PML的Cu2p精细谱。
[0028]图3为不同条件下PML催化的胶原交联度：图3a为PML浓度；图3b为BAPN加入量；图3c为反应时间；图3d为PML的放置温度。
[0029]图4a为PML催化胶原交联反应的底物浓度
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催化速率曲线图；图4b为相应的Lineweaver
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，其特征在于，它是由多肽序列Pep与铜离子构建而成；所述的多肽序列Pep序列为：HQHYHGGGGS
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DOPA
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DDDD。2.根据权利要求1所述的一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，其特征在于，多肽序列Pep分子式为：。3.根据权利要求1所述的一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，其特征在于，Pep通过组氨酸咪唑氮和邻醌氧与二价铜离子发生结合。4.根据权利要求1所述的一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，其特征在于，Pep多肽序列HQHYHGGGGS
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DOPA
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DDDD，其中HQHYH为铜离子结合序列，DOPA为赖氨酰氧化酶的辅因子——赖氨酸酪氨酸醌(LTQ)的模型氨基酸，GGGGS为连接序列，DDDD为底物亲和序列。5.根据权利要求1所述的一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，其特征在于，Pep与Cu
2+
的相互作用位点为His292、His294、His296的咪唑氮和DOPA氧化态的邻苯醌，形成稳定的四配位结构。6.权利要求1～5任一项所述的具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)Pep的合成：采用固相合成方法，以Rink
‑
Amide
‑
MBHA树脂为固相载体，哌啶为Fmoc脱保护试剂，苯并三氮唑
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N,N,N',N'
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四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N
‑
二异丙基乙胺(DIEA)为缩合试剂和活化试剂，TFA
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Tis
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H2O为切割液，冰乙醚为多肽沉淀溶剂，合成Pep粗品，经制备液相纯化，冻干得到Pep纯品；(2)PML的制备：将等摩尔浓度的Pep与CuCl2水溶液等体积混匀，用NaOH调节pH至弱碱性，室温下氧化并反应，经透析除去游离CuCl2后冷冻干燥得到PML产物。7.根据权利要求6所述的具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)Pep合成：树脂溶胀：称取Rink
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Amide
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MBHA树脂置于离心管中，加入二氯甲烷(DCM)溶胀，转移至多肽合成管中，分别用二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)洗涤数次；脱保护：加入哌啶振荡，脱去树脂上的Fmoc保护基，重复脱保护一遍后，按上述步骤洗涤树脂；氨基酸活化：称取Fmoc
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Asp(OtBu)
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OH置于离心管，加入DMF溶解，再分别加入配制好的HBTU和DIEA溶液，混匀活化；缩合反应：将活化后的氨基酸加入多肽合成管中，振荡反应；反应结束后洗涤树脂，并脱除Fmoc保护，再加入下一个氨基酸反应，如此循环直到最后一个氨基酸反应结束；
切割树脂：反应结束脱除Fmoc后洗涤树脂肽，转移至离心管，加入切割液进行切割裂解反应；乙醚沉淀：将多肽溶液倒入冰乙醚中，离心，弃去上清液后加入冰乙醚，使沉淀混匀后离心，如此重复，放置于真空干燥箱中除去溶剂，得到粗品Pep；粗品Pep经制备液相纯化后冷冻干燥得到Pep纯品；(2)PML的制备：称取Pep纯品，溶解于超纯水中，制得Pep溶液，称取CuCl2，溶解于超纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志鹏，徐柳，徐珊，吴丽，李伟东，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：