脂肪酸脱羧酶OleT制造技术

本发明专利技术公开了一种脂肪酸脱羧酶OleT

【技术实现步骤摘要】
脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体地说，本专利技术涉及一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体及其应用。

技术介绍

[0002]化石燃料短缺、严重的环境问题推动了可再生、可持续和低成本生物燃料的发展。在不同类型的生物燃料中，烯烃因其高能量含量、低吸湿性以及与现有发动机和分配系统的兼容性而备受关注，成为石油燃料的理想替代品。目前烯烃的化学合成法主要是乙烯聚合合成，这种合成方法只能生产偶数个碳链长度的烯烃，同时高温、高能耗、反应条件剧烈，不符合绿色化学的发展理念。
[0003]细胞色素P450(CytochromeP450，CYP)酶是一种具有硫酸
‑
血红素辅基的超家族蛋白质，以其多种催化活性和接受多种底物的能力而受到广泛关注。根据催化性质，P450酶可分为单加氧酶、过氧化物酶和过加氧酶。与生物燃料相关的P450脂肪酸脱羧酶(fattyaciddecarboxylases，FADCs)，如来自Jeotgalicoccussp.ATCC8456的OleT
JE
属于CYP152过加氧酶家族。该P450酶家族利用H2O2(而不是大多数P450单加氧酶使用的O2)作为氧化剂来支持氧化脱羧反应，该反应将C
n
(n＝6
‑
20)链长游离脂肪酸(FFAs)转化为C
n
‑1链长1
‑
烯烃(即α
‑
烯烃)。由于α/>‑
烯烃既是优良的生物燃料分子，也是润滑剂、洗涤剂和其他化学品的前体物质，P450FADCs在生产生物α
‑
烯烃方面具有广阔的应用前景。
[0004]在已报道的文献中，CYP152过加氧酶家族只有OleT
JE
、OleT
SA
、OleT
SQ
、OleT
JH
这几种生物催化剂，而其中研究相对深入的只有OleT
JE
。OleT
JE
是目前在催化效率和化学选择性(即脱羧)方面生产α
‑
烯烃的最佳生物催化剂，但一些方法如氧化还原分子伴侣工程和光催化体系的开发也未能成功提高OleT
JE
的脱羧活性，尤其是长链脂肪酸的脱羧效率都很低。
[0005]因此，发现或设计一种新型CYP152生物催化剂，能够更有效将FFAs转化为α
‑
烯烃、尤其是催化长链脂肪酸脱羧至关重要。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于提供一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体及其应用。
[0007]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0009]本专利技术的第二方面，提供了一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]本专利技术的第三方面，提供了上述脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体或脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体的编码基因在催化脂肪酸脱羧反应中的应用。
[0011]本专利技术的第四方面，提供了一种插入有上述脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体的编码
基因的重组表达载体。
[0012]本专利技术的第五方面，提供了一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌株。
[0013]本专利技术的第六方面，提供了上述重组表达载体或重组工程菌株在催化脂肪酸脱羧反应中的应用。
[0014]本专利技术的第七方面，提供了一种催化C18饱和脂肪酸脱羧反应的方法，使用上述脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体进行催化反应。
[0015]在本专利技术中，通过对脂肪酸脱羧酶OleT
PM
定点突变后进行脂肪酸脱羧效果验证发现，同等条件下突变体OleT
PM
‑
F291W和突变体OleT
PM
‑
F291Y对C18饱和脂肪酸的脱羧效率相较野生型OleT
PM
有了大幅度提升，因此，OleT
PM
突变体不仅丰富了P450FADCs的种类，增添特异性催化长链脂肪酸脱羧生成α
‑
烯烃的OleT酶种类，为P450FADCs的进一步工程设计提供了重要的指导，在α
‑
烯烃生物烃的生产中有着广阔的工业应用前景。
附图说明
[0016]图1为本专利技术实施例2中OleT
PM
的SDS
‑
PAGE蛋白胶图；其中，M：蛋白marker；1：OleT
PM
总菌；2：OleT
PM
上清；3：OleT
PM
沉淀；4：OleT
PM
穿过；5：0.25M咪唑洗脱OleT
PM
纯酶。
[0017]图2为本专利技术实施例2中OleT
PM
突变体的SDS
‑
PAGE蛋白胶图；其中，M：蛋白marker；1：OleT
PM
‑
F291Y纯酶；2：OleT
PM
‑
F291W纯酶；3：OleT
PM
‑
F291K纯酶；4：OleT
PM
‑
A71L纯酶；5：OleT
PM
‑
A72W纯酶。
[0018]图3为本专利技术实施例3中OleT
PM
催化不同链长脂肪酸脱羧底物的效率。
[0019]图4为本专利技术实施例5中OleT
PM
‑
F291W催化不同链长脂肪酸脱羧底物的效率。
[0020]图5为本专利技术实施例5中反应时间对OleT
PM
‑
F291W催化肉豆蔻酸脱羧效率的影响图。
[0021]图6为本专利技术实施例5中反应温度对OleT
PM
‑
F291W催化肉豆蔻酸脱羧效率的影响图。
[0022]图7为本专利技术实施例5中反应pH对OleT
PM
‑
F291W催化肉豆蔻酸脱羧效率的影响图。
具体实施方式
[0023]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0024]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.一种脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.权利要求1所述的脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体、或权利要求2所述的脂肪酸脱羧酶OleT
PM
的突变体的编码基因在催化脂肪酸脱羧反应中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝东明，高书悦，王永华，杨博，王方华，
申请(专利权)人：广东优酶生物制造研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：