改善重组蛋白制备的方法和组合物技术

本发明专利技术公开了经过修饰从而增强重组蛋白表达，例如，Ａβ肽结合抗体的表达，和／或降低或消除错误剪接和／或内含子连读（ＩＲＴ）副产物的核酸分子。本发明专利技术还提供了在适合重组Ａβ肽结合抗体表达的细胞培养条件下，通过表达这样的核酸分子，制备没有错误剪接和／或内含子连读副产物的Ａβ肽结合抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善重组蛋白制备的方法和组合物 相关申请的交叉引用本申请要求递交日为2004年10月5日的美国专利申请第 60/616,474号的优先权，在此将其全文引用作为参考。专利技术背景至少从1980年代的中期就已存在制备重组蛋白的表达载体。通 常，用于重组蛋白表达的基于载体的策略大量地被应用于蛋白制剂绝 对纯度并不重要的基础研究和小规模实验中。相反，当重组蛋白被用 于治疗应用时，即使是少量的污染，例如错误剪接或内含子连读副产 物的存在都会降低所得治疗性蛋白的活性和产量。向患者给药具有错 误剪接或连读蛋白序列的治疗性蛋白会增加不希望的副作用的可能 性。这样的副产物同样也会给生产造成了麻烦。副产物的存在会对纯 化过程造成危害，因为这样的副产物通常在大小，亲合力，或生物活 性方面都与所希望的蛋白非常相似。而且，现已观察到，与所希望的 产物相比较，使用重组宿主细胞按比例放大蛋白表达通常都会导致副 产物量的增加，尤其是如果细胞是在略差于最适细胞培养条件下进行 培养的。这样的非最适细胞培养条件常常出现在大规模蛋白制备中， 例如，在生物发酵罐运行的后期，或者，出于其他的原因，当所述大 规模培养物的健康情况恶化时。因此，需要改进重组蛋白制备，尤其是大规模治疗性蛋白制备的 方法。专利技术概述本专利技术提供了改善重组蛋白或肽表达和/或制备的方法和组合物。 在一个实施方案中，提供了经过修饰从而降低或消除错误剪接和/或内 含子连读副产物，和/或增强重组蛋白表达的核酸分子。在某些实施方 案中，所述核酸编码重组抗体(在本文中也可称为免疫球蛋白)，或其片 段。本专利技术还包括经过修饰从而降低或消除错误剪接和/或内含子连 读副产物和/或从而增强重组蛋白表达的载体(例如，表达载体)；包括 这些核酸分子和载体的宿主细胞，例如，哺乳动物细胞；以及培养这 些细胞从而制备，例如，以大规模制备所述重组蛋白或肽的方法。本 专利技术还公开了基本上不含有错误剪接和/或内含子连读产物的重组蛋白 或肽，例如抗体的组合物，'例如药物组合物。这些组合物适用于治疗 性用途，包括，例如，神经变性和恶性疾病。特别地，本专利技术提供了表达用于治疗神经变性疾病的治疗性抗体 的组合物和方法。这些抗体的完整性尤其重要，因此，例如，每单位 剂量的分子治疗活性得以保持且其纯化得以改善。亟待改善这些旨在 具有特化功能蛋白的纯度，从而在治疗某些生物学适应症，例如神经 变性疾病中得以传递和使用，在该疾病中治疗性多肽能透过血脑屏障 (BBB)并结合于大脑中的耙抗原。如本专利技术所述的示例性抗体是高纯度 制备的，其结合于神经变性疾病靶位，例如，阿耳茨海默氏病的淀粉 样蛋白，即淀粉样-Z3肽(AP)的抗体。因此，在一方面，本专利技术的特征在于核酸分子(例如，修饰的或重 组核酸分子)，所述核酸分子包括了这样的核苷酸序列，该核苷酸序列 具有一种或多种内含子和外显子序列，与天然存在的基因组序列相比 较，其中至少一种内含子序列被修饰从而增强了蛋白表达和/或降低或 消除了错误剪接或内含子连读(IRT)副产物。在一个实施方案中，所述 核酸分子旨在相对于天然存在序列(例如，基因组序列)，增强所希望的 蛋白或肽，例如，抗体或其片段(例如，免疫球蛋白重链)的表达和/或降低或消除其内含子连读(IRT)副产物。所述蛋白或肽可以是哺乳动物， 例如人或鼠类来源的，通常是人源的。在本说明书中所述的核酸分子 也可理解为来自天然存在的序列的修饰形式。在某些实施方案中，所 述核酸分子是分离或纯化的。在其他实施方案中，所述核酸分子是重 组分子。在一个实施方案中，与天然存在序列(例如，基因组序列)相比，所 述核酸分子具有至少一个，两个，三个内含子或直至除了一个之外的 全部内含子缺失。例如，可从所述天然存在序列中缺失一个能够协助内含子连读(IRT)的内含子。在其他实施方案中，可通过内含子/外显子构型重排(例如，内含子/外显子5'到3'顺序)； 一个或多个内含子部分 的缺失；或用异源内含子序列替换内含子或其部分的方式中的一种多 种对核酸分子进行修饰，由此产生了蛋白表达的增强和/或错误剪接或内含子连读(IRT)副产物的降低或消除。在相关实施方案中，所述核酸分子包括编码抗体重链或其片段的 核苷酸序列(例如，人基因组序列)。例如，所述核苷酸序列可包括编码免疫球蛋白亚型，例如免疫球蛋白G亚型(例如，IgGl， IgG2， IgG3 或lgG4抗体亚型)重链可变区，铰链区，以及第一，第二和第三恒定区 (例如，CH1， Ch2， CH3)的一种或多种核苷酸(例如，外显子)序列。通 常，所述免疫球蛋白亚型来自于哺乳动物来源，例如鼠类或人。在一 个实施方案中，选择的是人IgGl或lgG4，或其突变的形式。例如，免疫球蛋白的恒定区可被突变从而导致以下情况中的一种或多种稳定 性增加，效应器功能降低，或补体结合降低。在一个实施方案中，人 IgG4突变，从而增加了稳定性，例如，在241位残基从丝氨酸替换为 脯氨酸从而增加了铰链区的稳定性。在其他实施方案中，恒定区突变 从而降低了糖基化。在一个实施方案中，对核酸分子进行修饰从而缺失了至少一个协 助内含子连读该序列的内含子。例如，在免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3之间的内含子可被缺失。其他可单独或组合缺失的重链免疫球 蛋白内含子的例子包括重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区CH1之间 的内含子，CH1和铰链区之间的内含子，以及铰链区和免疫球蛋白重链恒定区CH2之间的内含子。前述内含子的任意组合均可被缺失，包括上述内含子的两个，三个内含子的组合，或直至除了一个内含子的全 部内含子的组合。在一些实施方案中，所述重链恒定区的三个内含子，例如CH1和铰链区之间的内含子，铰链区和CH2之间的内含子，以及 CH2和CH3之间的内含子缺失。以下重链免疫球蛋白内含子缺失的示 例性组合也在本专利技术的范围之内免疫球蛋白重链恒定区CH1和铰链 区之间的内含子，以及CH2和CH3之间的内含子；CH1和铰链区之间 的内含子，以及铰链区和CH2之间的内含子；铰链区和CH2之间的内 含子，以及Ch2和Ch3之向的内含子。在一些实施方案中，所述核酸分子含有如下式所代表的核苷酸序列VH-Intl-CHl-Int2-铰链誦Int3-CH2-CH3，其中VH是编码重链可变区的核苷酸序列；CH1， CH2和CH3是编码对应重链恒定区，例如人IgGl或IgG4 重链基因的天然存在或突变形式的核苷酸序列；铰链是编码重链恒定区，例如人IgGl或IgG4重链基因的天然存 在或突变形式的铰链区的核苷酸序列；且Intl， Int2， Int3和Int4是来自重链基因组序列的内含子。在一个 实施方案中，在CH2和CH3之间，在本说明书中以Int4代表的内含子 缺失。在其他实施方案中，在CHl和铰链区之间，在铰链区和CH2之 间，和/或在CH2和CH3之间，在本说明书中以Int2， Int3和Int4代表 的内含子中的一种，两种或通常是三种缺失。其他重链基因组序列的 内含子/外显子排列示意图可见于图1，图5和图7。通常，在核酸分子中存在有至少一种内含子，例如，在重链可变 区和CHl之间的内含子，在本说明书中以Intl代表。其他可单独或组合存在的重链免疫球蛋白内含子示例包括免疫球蛋白重链恒本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码Ａβ－抗体链的核酸分子，所述核酸分子含有具有一或多个内含子和外显子序列的核苷酸序列，与天然存在的基因组序列相比较，其中至少一个内含子序列缺失从而降低了错误剪接或内含子连读（ＩＲＴ）副产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁西纳科雷，杰森劳斯，
申请(专利权)人：艾兰制药国际有限公司，惠氏公司，
类型：发明
国别省市：IE[爱尔兰]