一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用，该方法设计靶位点gRNA

【技术实现步骤摘要】
一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用


[0001]本专利技术涉及水产生物育种
，具体涉及一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用。

技术介绍

[0002]草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是鲤科草食性鱼类，为我国四大家鱼之一，是我国产量最大的淡水经济养殖鱼类，产量在2021年达到575.51万吨(FAO,2022)。草鱼性成熟周期在5
‑
6年，如采用常规混合选育方法,常规育种周期漫长，目前草鱼没有经审定的良种。为了缩短草鱼的育种周期，需进一步探索新的草鱼育种的理论、技术和方法(邹曙明等，2013)。草鱼以其肉质好、蛋白质要求低与适应性强的特点在养殖鱼类的产量中居第一位。但目前其种质却存在没有选育的品种、苗种成活率低且病害损失日趋严重，培育适合产业需求的新品种已是大势所趋(赵金良等，2008；邹曙明等，2013)。
[0003]基因编辑技术(Gene Editing)能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、敲入等操作(王峰等，2018)，包含ZFN(Zinc finger nucleases)、TALEN(Transcription activator
‑
like effector nucleases)和CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。目前基因编辑技术已广泛用在经济鱼类性状改良和基因功能研究方面。Sun et al.(2016)运用CRISPR
‑
Cas9方法敲除团头鲂的mstna和mstnb基因后，提高了团头鲂肌肉的生产性能(专利技术专利：CN201910743873.4)。胡炜等第一次在黄鳝(Monopterus albus)的胚胎上运用TALEN方法成功构建了Dmrt1基因的突变体(专利技术专利：CN106222204B)。Wu et al.(2022)运用CRISPR
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Cas9基因编辑技术突变尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的mstnb基因，发现突变的尼罗罗非鱼在七月龄较野生型体重增长50％左右，为提高尼罗罗非鱼养殖产量提供重要支撑(专利技术专利申请号：CN114438132A)。
[0004]然而，草鱼的基因功能和遗传改良育种等方面研究却进展缓慢，一直受制于有效基因编辑方法的缺乏，传统的单一靶位点突变，打靶效率较低，容易造成无义突变。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对传统的单一靶点敲除，打靶效率较低，DNA自主修复不确定性高容易造成无义突变的缺陷，提供了一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法及应用；本专利技术选取草鱼runx2b基因(该基因全长53575bp，包含6个外显子和5个内含子)，在该基因的结构域的两个外显子上设计合成两个靶位点，然后，通过体外转录合成靶基因的两个gRNA和Cas9蛋白的mRNA，然后将两者混合，然后采用显微注射的方式将混合物导入草鱼1细胞期的受精卵的动物极中，孵化后即可获得靶基因突变的草鱼F0代。本专利技术高效地实现了草鱼基因敲除，为开展草鱼的育种和基因功能研究提供了有效的技术手段。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法，包括以下步骤：
[0008]1)根据CRISPR/Cas9敲除原理，针对runx2b基因的第三外显子和第五外显子分别
设计靶位点gRNA
‑
1序列和靶位点gRNA
‑
2序列；
[0009]2)以保守的下游Scaffold引物与带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
1序列/靶位点gRNA
‑
2序列的上游引物进行overlap PCR扩增并纯化；以上述纯化后的PCR产物为模板，体外转录并纯化分别获得gRNA
‑
1和gRNA
‑
2；
[0010]3)以pT3TS
‑
nCas9n线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；
[0011]4)将gRNA
‑
1、gRNA
‑
2和Cas9 mRNA混合显微注射到草鱼1细胞期的受精卵中；
[0012]5)培育草鱼至三个月时，剪草鱼的尾鳍提取DNA，筛选出有突变的草鱼培育成亲本F0代；继续繁殖培育到多代获得缺失runx2b的纯合子，才是稳定的突变品系。
[0013]进一步地，所述步骤1)中，靶位点gRNA
‑
1序列为：
[0014]runx2b
‑
1target：5
‘‑
GAGTTATGAAGAACCAGG
‑’
3，
[0015]靶位点gRNA
‑
2序列为：
[0016]runx2b
‑
2target：5
‘‑
GCTCAATCTTCCCCACCT
‑’
3。
[0017]再进一步地，所述步骤2)中，下游引物Scaffold：
[0018]5‘‑
GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
‑’
3；
[0019]带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
1序列的上游引物：
[0020]5‘‑
AATTAATACGACTCACTATAGGGAGTTATGAAGAACCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑’
3。
[0021]带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
2序列的上游引物：
[0022]5‘‑
AATTAATACGACTCACTATAGGGCTCAATCTTCCCCACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑’
3。
[0023]再进一步地，所述步骤2)中，纯化gRNA的方法为氯化锂沉淀，具体步骤为：
[0024]向gRNA体外转录体系中加入1μl DNase I孵化15分钟去除残留DNA，加入2μl 0.2M的EDTA终止反应后，加入2.5ul 4M的氯化锂和75μl的预冷无水乙醇，
‑
20℃沉淀16h；离心收集沉淀物，加入50μl 70％预冷的乙醇清洗沉淀，离心去除乙醇，加入25μl DEPC水溶解沉淀；取1μL测RNA浓度，并通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量后装置于
‑
80℃冰箱保存待用，即为gRNA。
[0025]再进一步地，所述步骤4)中，gRNA
‑
1和gRNA<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据CRISPR/Cas9敲除原理，针对runx2b基因的第三外显子和第五外显子分别设计靶位点gRNA
‑
1序列和靶位点gRNA
‑
2序列；2)以保守的下游Scaffold引物与带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
1序列/靶位点gRNA
‑
2序列的上游引物进行overlap PCR扩增并纯化；以上述纯化后的PCR产物为模板，体外转录并纯化分别获得gRNA
‑
1和gRNA
‑
2；3)以pT3TS
‑
nCas9n线性化质粒为模板，体外转录合成Cas9mRNA；4)将gRNA
‑
1、gRNA
‑
2和Cas9 mRNA混合显微注射到草鱼1细胞期的受精卵中；5)培育草鱼至三个月时，剪草鱼的尾鳍提取DNA，筛选出有突变的草鱼培育成亲本F0代；继续繁殖培育到多代获得缺失runx2b的纯合子，才是稳定的突变品系。2.根据权利要求1所述一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法，其特征在于：所述步骤1)中，靶位点gRNA
‑
1序列为：runx2b
‑
1target：5
‘‑
GAGTTATGAAGAACCAGG
‑’
3，靶位点gRNA
‑
2序列为：runx2b
‑
2target：5
‘‑
GCTCAATCTTCCCCACCT
‑’
3。3.根据权利要求1所述一种在草鱼中双gRNA位点敲除runx2b基因的方法，其特征在于：所述步骤2)中，下游引物Scaffold：5
‘‑
GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
‑’
3；带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
1序列的上游引物：5
‘‑
AATTAATACGACTCACTATAGGGAGTTATGAAGAACCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
‑’
3。带有T7启动子的特异性包含靶位点gRNA
‑
2序列的上游引物：5
‘‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高泽霞，聂春红，张东洋，吴亚明，董强，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：