用于制备基于扩增检测病原体的生物样品的提取溶液制造技术

本发明专利技术提供了用于使用没有预先进行靶标纯化的粗制生物样品基于扩增检测靶核酸和病原体的方法和试剂盒。原体的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备基于扩增检测病原体的生物样品的提取溶液


[0001]本专利技术描述了一种提取组合物，其允许在无需预先提取和纯化靶核酸的情况下，通过PCR通过病原体的核酸基因组直接检测该病原体，尤其是RNA病毒如SARS
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CoV
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2。
[0002]将根据本专利技术的提取组合物添加至粗制生物样品中，由此使所制样品，在无需预先纯化靶核酸的情况下，与后续的一种或多种靶核酸的直接扩增相容。与现有技术方法相比，本专利技术的技术增加了灵敏度。此外，还提供了一些手段，以避免由于制备的生物样品中的组分对扩增反应的抑制而导致的灵敏度下降。

技术介绍

[0003]检测生物样品中是否存在靶核酸的方法被广泛使用，在诊断领域具有特殊意义。此类方法被广泛用于确定对象是否感染了目标病原体。检测病原体(例如细菌或病毒)的标准程序是证明病原体的基因组核酸(即DNA或RNA)的存在。在标准的现有技术方法中，使用文献中描述的样品制备方法从患者样品中纯化病原体(例如病毒)的核酸。然后将纯化的核酸应用于核酸扩增反应，扩增并检测以确定病原体是否存在。
[0004]由于其灵敏度，聚合酶链反应(PCR)经常用于检测，具体是病毒的检测。如本领域已知的，对于具有RNA基因组的病毒，在通过PCR检测之前需要将RNA转化为DNA的另外步骤。催化该过程的酶是逆转录酶(RT)。将RNA转录成cDNA并随后通过PCR扩增基因组，通常称为RT
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PCR并广泛用于本领域。该技术已被广泛用于各种人类致病病毒，包括但不限于冠状病毒科，例如SARS
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CoV[
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1](严重急性呼吸系统综合征冠状病毒[1])、MERS
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CoV(中东呼吸系统综合征冠状病毒)和SARS
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CoV
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2(严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2)。
[0005]为了检测许多病原体，包括SARS
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CoV
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2(Covid
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19疾病的病因)，需要从对象身上获取生物样品，例如通过鼻咽或口咽拭子。然后将带有收集的生物样品的拭子放入介质中，例如UTM(通用运输介质；科潘恩公司(Copan))或VTM(病毒运输介质；CDC：https://www.cdc.gov/coronavirus/2019
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ncov/downloads/Viral
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Transport
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Medium.pdf)用于运输并送到实验室以进一步进行基于扩增的分析。然后使用病毒DNA/RNA提取方法(例如QIAamp病毒RNA微型试剂盒；QIAGEN)从收集的生物样品中分离核酸，包括SARS
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CoV
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2RNA基因组(如果存在于收集的样品中)，然后通过特异性PCR检测病毒RNA基因组的一种或多种靶核酸。从收集的生物样品中预先纯化核酸提供了含有用于扩增反应模板的纯洗脱液。预先去除生物样品本身或收集介质中所含的扩增反应的杂质和抑制剂，从而确保扩增反应不被抑制并且可以高灵敏度地检测是否存在靶标。
[0006]然而，在大流行的情况下(例如在当前的Covid
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19大流行中)，必须在尽可能短的时间内分析大量患者样品，这种经典工作流程显示出明显的缺点。包括核酸分离步骤的初始样品制备会减慢整个诊断过程，即使该方法以自动化方式进行也是如此。因此，这会导致诊断中出现不期望和不可接受的积压。此外，由于大流行期间需要处理的样品数量众多，因此存在所需核酸提取试剂短缺的风险，从而进一步增加了积压。因此，迫切需要可靠和灵敏的方法，其允许基于扩增检测收集的生物样品中是否存在病原体，而无需在进行基于扩增
的检测之前纯化靶核酸。
[0007]鉴于这一迫切需要，开发了几种方法，其旨在规避涉及核酸纯化的样品制备步骤，而是旨在直接从运输介质中检测病原体(例如SARS
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CoV
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2)，这意味着生物样品的等分部分在其运输介质中直接接受标准PCR反应。这在预印本服务器bioRxiv(https://www.biorxiv.org/)和medRxiv(https://www.medrxiv.org/)上发布的许多出版物中都有描述。然而，不足为奇的是，运输介质的组分严重抑制了PCR，导致Ct值显著增加，以及因此所致的不可接受的灵敏度损失。因此，标准PCR组合物不适用于直接检测，如例如Alcoba
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Florez等(2020)和Foomsgard ans Rosenstierne(2020)中所述。
[0008]也有一些商业化的PCR试剂盒可以应对直接应用运输介质的情况。然而，它们仍然需要对原始样品进行耗时的手动预处理步骤，例如加热后离心(Takara；PrimeDirect Probe RT
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qPCR混液(PrimeDirect Probe RT
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qPCR Mix))或添加预处理溶液后加热(Shimadzu；2019冠状病毒检测试剂盒)。这些系统的另一个限制是，即使在预处理步骤之后，也只能应用于有限量的样品，与病毒RNA纯化后的PCR检测相比，这也可能导致灵敏度降低。
[0009]先前的研究还调查了初始热灭活步骤对PCR灵敏度和准确性的影响。这些研究一致证实，在通过PCR检测SARS
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CoV
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2之前加热样品会导致Ct值显著增加，从而降低检测率，这与加热步骤后是否提取病毒核酸无关，也与使用的试验方法无关(E、N、ORF1 ab)(Zou等，2020；Alcoba
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Florez等，2020；Fomsgaard&Rosenstierne，2020)。在病毒载量低的情况下，这种灵敏度损失尤其成问题。此外，从这些先前的报道可以看出，即使在省略核酸提取步骤时可以检测到信号并节省时间，但这些直接方法在PCR灵敏度和准确性方面无法与已建立的结合病毒核酸提取步骤标准方法相当，该步骤目前是SARS
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2检测领域的黄金标准(Alcoba
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Florez等，2020；Fomsgaard&Rosenstierne，2020)。
[0010]因此，本专利技术的一个目的是规避现有技术的缺点并提供改进的技术(例如方法和试剂盒)，用于生物样品中包含的靶核酸的基于扩增的检测。
[0011]另一目的是提供一种能够使用基于扩增的方法检测是否存在病原体(例如SARS病毒)的方法，该方法避免了预先核酸纯化，同时确保扩增反应的良好灵敏度。具体地，需要避免耗时的预处理步骤的快速方法。因此，本专利技术的另一个目的在于，还提供一种基于快速、直接扩增的方法，该方法不需要纯化病原体核酸(例如SARS
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CoV
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2RNA)，并且避免了复杂的预处理步骤。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备生物样品的方法，所述生物样品用于在没有预先进行靶核酸纯化的情况下基于扩增检测所述生物样品中包含的至少一种靶核酸，所述方法包括
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使生物样品与提取组合物接触，所述提取组合物包含：(a)至少一种表面活性剂，(b)至少一种核酸酶抑制剂，和(c)任选地至少一种还原剂，和
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孵育包含所述生物样品与所述提取组合物接触的混合物，以提供用于基于扩增检测靶核酸的制备的生物样品。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂为非离子表面活性剂，其中所述非离子表面活性剂为基于聚氧乙烯的非离子表面活性剂，优选选自以下组：(aa)聚氧乙烯脂肪酸酯，具体是聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯；(bb)聚氧乙烯脂肪醇醚；(cc)聚氧乙烯烷基苯基醚；和(dd)聚氧乙烯
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聚氧丙烯嵌段共聚物，任选地，其中所述提取组合物包含聚氧乙烯脂肪酸酯作为非离子表面活性剂，其包含
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源自月桂酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯和油酸酯的脂肪酸，
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含有4至100、6至50或6至30个(CH2CH2O)单元的聚氧乙烯组分，其中优选地，聚氧乙烯脂肪酸酯选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核酸酶抑制剂为蛋白质RNA酶抑制剂。4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其中所述提取组合物包含(c)还原剂，并且其中所述还原剂选自三(羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、N
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乙酰半胱氨酸、THPP(三(羟丙基)膦)、1
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硫代甘油和β
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巯基乙醇，并且其中优选地，提取组合物包含三(羧乙基)膦(TCEP)。5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的方法，其中所述提取组合物为选自以下实施方式的提取溶液：(i)所述提取溶液包含(a)至少一种非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)至少一种还原剂；(ii)所述提取溶液包含(a)至少一种基于聚氧乙烯的非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)选自三(羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、N
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乙酰半胱氨酸、THPP(三(羟丙基)膦)和1
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硫代甘油的至少一种还原剂；(iii)提取溶液的活性成分基本由以下物质组成(a)非离子表面活性剂，优选基于聚氧乙烯的非离子表面活性剂，(b)蛋白质RNA酶抑制剂，和
(c)还原剂，优选选自三(羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、N
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乙酰半胱氨酸、THPP(三(羟丙基)膦)和1
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硫代甘油；(iv)所述提取溶液包含(a)至少一种聚山梨醇酯，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)三(羧乙基)膦(TCEP)；(v)提取溶液的活性成分基本由以下物质组成(a)聚山梨醇酯，(b)蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)三(羧乙基)膦(TCEP)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法包括：在不存在提取组合物的情况下，用适于灭活病原体的温度加热生物样品以灭活病原体，然后使经病原体热灭活的生物样品与提取组合物接触，任选地，其中用于在使热灭活的生物样品与提取组合物接触之前灭活生物样品中包含的病原体的加热包括加热生物样品至≥80℃或≥85℃，优选≥90℃或≥95℃。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其具有以下特征中的至少一个：(aa)至少一种靶核酸选自RNA和/或DNA；(bb)至少一种靶核酸是病原体源性核酸，其中所述病原体选自以下组：病毒、细菌、原生动物、类病毒和真菌；(cc)至少一种靶核酸是源自病毒，优选RNA病毒的病毒核酸；(dd)至少一种靶核酸是源自RNA病毒的病毒RNA；(ee)至少一种靶核酸源自冠状病毒，具体是对人类具有传染性的冠状病毒；(ff)靶核酸由源自相同病原体的两种或更多种靶核酸提供。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种靶核酸源自SARS
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2，任选地，其中所述靶核酸序列源自SARS
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CoV
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2基因N、N1、N2、RdRP、E和/或Orf1b。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述生物样品为呼吸道试样，优选选自鼻咽、口咽和鼻腔样品。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含在介质中，任选地，其中所述介质具有以下特征中的至少一种：(aa)其包含汉克斯平衡盐溶液；(bb)其为含盐溶液；(cc)其为生理盐溶液；(dd)其为包含0.7％至1.2％(w/v)或0.8％至1％(w/v)碱金属盐的溶液；(ee)其为0.9％(w/v)氯化钠溶液；(ff)其为磷酸盐缓冲液，任选地，PBS缓冲液；(gg)所述介质包含或由以下组分组成：汉克斯平衡盐溶液、通用运输介质(UTM)、病毒运输介质(VTM)，或总盐浓度在上述介质中一种或多种的
±
30％或
±
20％范围内的介质。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述在孵育包含生物样品、提取组合物和任选地介质的混合物之后，该方法进一步包括：
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使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行酶促反应，优选逆转录和/或扩增反应，并进行酶促反应。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酶促反应包括扩增反应，任选地，其中所述扩增反应具有以下特征中的一个或多个：(i)其为逆转录扩增反应；(ii)其为逆转录PCR；(iii)其为等温扩增反应；(iv)其为聚合酶链式反应(PCR)；(v)其为定量PCR；(vi)其为定量逆转录PCR；(vii)其为数字PCR。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中经酶促反应的所述制备的生物样品提供酶促反应总反应体积的至少20％、至少30％、至少40％或至少45％，任选地，其中经酶促反应的所述制备的生物样品提供酶促反应总反应体积的至多60％或至多50％。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法用于制备生物样品，所述生物样品用于在没有预先进行核酸纯化的情况下，基于扩增检测所述生物样品中包含的至少一种致病性RNA靶核酸，所述方法包括
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使生物样品与提取溶液接触，所述提取溶液包含：(a)至少一种非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)至少一种还原剂，以制备混合物，任选地，其中所述方法包括在不存在提取溶液的情况下加热生物样品以灭活可能包含于所述生物样品中的病原体，然后使经病原体热灭活的生物样品的至少等分部分与提取溶液接触；
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孵育所述混合物以提供制备的生物样品，所述制备的生物样品用于基于扩增检测至少一种致病性RNA靶核酸；
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使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行逆转录和扩增反应并进行该反应。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法用于制备生物样品，所述生物样品用于在没有预先进行核酸纯化的情况下，基于扩增检测至少一种致病性RNA靶核酸，所述方法包括
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使生物样品与提取溶液接触，所述提取溶液包含：(a)至少一种非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)至少一种还原剂，以制备混合物，其中所述混合物包含(i)源自提取溶液的非离子表面活性剂，其浓度范围在0.1％至10％(w/v)，任选地0.2％至5％(w/v)或0.3％至3％(w/v)，和(ii)源自提取溶液的还原剂，其浓度范围在0.1mM至15mM，任选地为0.2mM至10mM、0.3mM至5mM或0.4mM至1.5mM；任选地，其中所述方法包括在不存在提取溶液的情况下加热所述生物样品以灭活可能包含于所述生物样品中的病原体，然后使经病原体热灭活的生物样品的至少等分部分与提取溶液接触；
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孵育混合物以提供制备的生物样品，所述制备的生物样品用于基于扩增检测至少一
种致病性RNA靶核酸；
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使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行逆转录和扩增反应并进行该反应。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法用于制备生物样品，所述生物样品用于在没有预先进行核酸纯化的情况下，基于扩增检测至少一种致病性RNA靶核酸，所述方法包括
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使包含于介质中的生物样品与提取溶液接触，所述提取溶液包含：(a)至少一种非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)至少一种还原剂，以制备混合物，其中所述混合物包含(i)源自提取溶液的非离子表面活性剂，其浓度范围为0.1％至10％(w/v)，任选地0.2％至5％(w/v)或0.3％至3％(w/v)，和(ii)源自提取溶液的还原剂，其浓度范围在0.1mM至15mM，任选地为0.2mM至10mM、0.3mM至5mM或0.4mM至1.5mM；任选地，其中所述方法包括在不存在提取溶液的情况下加热生物样品以灭活可能包含于生物样品中的病原体，然后使经病原体热灭活的生物样品的至少等分部分与提取溶液接触；
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孵育所述混合物至少1分钟，优选至少1.5分钟或至少2分钟，以提供制备的生物样品，所述制备的生物样品用于基于扩增检测至少一种致病性RNA靶核酸；
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使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行逆转录和扩增反应并进行该反应；其中制备的经逆转录和扩增反应的生物样品提供逆转录和扩增反应的总反应体积的至少30％、至少40％或至少45％，和其中至少以下步骤
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将生物样品与提取溶液接触以制备混合物，
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孵育混合物，和
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进行逆转录扩增反应，在相同反应容器内进行。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法用于制备呼吸道生物样品，所述呼吸道生物样品用于在没有预先进行核酸纯化的情况下，基于扩增检测生物样品中包含的至少一种致病性RNA靶核酸，所述方法包括
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使包含于介质中的呼吸道生物样品与提取溶液接触，所述提取溶液包含：(a)至少一种非离子表面活性剂，(b)至少一种蛋白质RNA酶抑制剂，和(c)至少一种还原剂，以制备混合物，任选地，其中所述方法包括在不存在提取溶液的情况下加热包含于介质中的呼吸道生物样品，以灭活可能包含于所述生物样品中的病原体，然后使经病原体热灭活的生物样品的至少等分部分与提取溶液接触；
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孵育所述混合物以提供制备的生物样品，所述制备的生物样品用于基于扩增检测至
少一种致病性RNA靶核酸；
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使制备的生物样品的至少等分部分或全部进行逆转录和扩增反应，并进行所述反应以检测是否存在至少一种致病性RNA靶核酸；其中经逆转录和扩增反应的所述制备的生物样品提供逆转录和扩增反应(优选定量RT
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PCR反应)的总反应体积的至少30％或至少40％，并且其中至少以下步骤
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将包含在介质中的呼吸道生物样品与提取溶液接触以制备混合物，
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孵育所述混合物，和
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进行逆转录扩增反应，在相同反应容器内进行，并且其中所述逆转录和扩增反应包含引物，所述引物适用于扩增一种或多种，优选两种或更多种源自严重急性呼吸系统综合征相关冠状病毒，优选严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)的靶核酸。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括
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使生物样品与提取组合物接触，所述提取组合物包含：(a)至少一种非离子表面活性剂，其中包含与提取组合物接触的生物样品的所述混合物包含浓度在0.3％至5％(w/v)范围...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：恰根有限公司，
类型：发明
国别省市：